荧光PCR检测原理2PPT.ppt

遗传病通常是由于人体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生而引起的疾病。 突变检测原理 锚探针 突变探针 突变探针Tm值较锚探针低5℃ 不完全配对 完全配对 突变检测原理 不完全配对 完全配对 温度 低 中 高 Factor V 点突变检测 Forward Primer Reverse Primer DNA CGC CGC LC Red 640 LC Red 705 扩增子 Hybprobe Pair 1 Hybprobe Pair 2 双点突变的检测原理 双位点双色检测 Without ccc With ccc Mut 1 + Mut 2 WT1 + WT2 Het 1 + Het 2 H20 F2 F3 母婴传播的监控 荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。 肿瘤的诊断 荧光PCR的作用： 可对原癌基因的突变和易位等作出检测。 可对原癌基因的mRNA进行定量分析。 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。 探索癌变发生机理的研究提供参考。 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。 荧光PCR在血液筛查中的应用 NAT(Nucleic Acid Amplification Testing) NAT应用于血液筛查的意义 血液筛查现状 筛查方法：免疫学 输血危险性来源： 窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误 NAT可显著缩短窗口期，提高输血安全性 HBV：缩短6-15天 HCV：缩短41-60天 HIV：缩短10-15天 急性感染时期HIV的标志物 急性感染时期HCV的标志物 急性感染时期HBV的标志物 病毒颗粒 DNA RNA FQ-PCR RT-FQ PCR 裂解 荧光信号检测 核酸纯化系统 多通道荧光PCR自动检测系统 荧光PCR检测流程 自动加样 多样本混合（Mini pool） 规格：16-96donations “Pool”是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。 “Pool”的规格取决于临界阳性和所用NAT试剂的检测限度。 (据文献，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000 IU/ml，约1.35~2.4×104geq/ml;目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000 copies/ml) 筛查方法： 递减法 矩阵法 递减法 矩阵法 成本分析 前提： 试剂盒灵敏度（＜500 copies/ml) 24 minipool（矩阵法筛选） 阳性检出率=1/10000 以10000 donars 为例： 试剂用量:473 每份筛查成本=473*每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂费用 仪器设备要求 年采血量15吨~20吨： 核酸纯化系统 ×1 多通道荧光PCR自动检测系统 ×2 高速低温离心系统 ×1 Pooling Machine ×1 年采血量10吨左右： 核酸纯化系统 ×1 多通道荧光PCR自动检测系统 ×1 高速低温离心系统 ×1 选件：Pooling Machine ×1 Taqman原理： 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而受光刺激激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 定量PCR（quantitative PCR） 用PCR方法定量主要有两种： 终点定量（end point PCR）在PCR循环结束后对PCR扩增产物进行测定量化，而PCR到达平台期时检测重现性差，无法准确定量。 对数期定量（Log phase PCR）在PCR的对数增长期对PCR扩增产物进行测定量化，最大定量范围可达到10个数量级，如荧光定量PCR。 Standard Curve(标准曲线)：CT/TC/CP与起始模板量的对数呈反比关系： Y=-aX+b 其中X=Log Concentration Y=CT/