荧光定量PCR原理和应用-LQPPT.ppt

December,2004 TaqMan 探针 TaqMan 水解型杂交探针 目标特异性探针 5’ 为荧光基团， 3’ 为淬灭基团 5’ 荧光报告基团 3’淬灭基团 与目标序列互补 TaqMan 探针 探针完整时，R发射的荧光能量被Q吸收，无荧光 Taq酶有5’-3’外切酶活性，可以水解探针 R Q 报告基团 淬灭基团 R Q 报告基团被淬灭 F R R Q 在PCR进行中，探针与目的序列杂交 R Q 探针在延伸阶段部分解离 R Q 探针被DNA聚合酶的 5’端外切酶活性水解 R Q 解离的报告基团发出荧光 每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 TaqMan 探针 对目标序列有很高的特异性 ---特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比引物设计 相对简单 可以在一个反应中进行多个基因的定量 重复性比较好 TaqMan 探针 价格较高 只适合于一个特定的目标 背景高 TaqMan 探针 化学试剂 工作原理 有否淬灭剂 信号检测 主要应用范围 SYBR Green I 结合于双链DNA的小沟中 否 延伸后 熔解曲线分析 定量和检测目标基因 Molecular Beacons 发夹型杂交探针 是 复性 SNP分析 定量和检测目标基因 TaqMan探针 水解型杂交探针（5‘-3’外切） 是 任何步骤 SNP分析 定量和检测目标基因 OUTLINE 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法应用 实时荧光定量PCR的实验要素和 注意事项 实时荧光定量PCR应用 定量： DNA定量 RNA定量 定性： 点突变分析 SNP分析 基因型分析 DNA甲基化分析 熔解曲线分析 内源基因拷贝数的鉴定 转基因拷贝数的检测 DNA定量－拷贝数研究（替代Southern Blot） 实时荧光定量PCR应用 RNA定量－基因表达差异（替代Northern Blot) 不同组织器官、不同时期、不同处理单个或多个基因地表达谱分析 绝对定量与相对定量 相对定量：在被测样本中靶序列相对于参照样本的量的变化 差异表达分析 芯片评估 转基因成分含量检测 绝对定量：精确计算样本中靶序列浓度（DNA，RNA），即通常所说的拷贝数 病毒DNA或RNA的拷贝数 转基因的拷贝数 绝对定量 ——通过标准样品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 相对定量的目的 比较靶序列在不同样本中的量的差异（倍数关系） 如何实现准确的相对定量？ ---解决模板提取过程中造成的差别 ---解决加样过程中的差别 如何保证不同样品（RNA或DNA）上样量的一致? 相对定量 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 内标数量代表样本中所含细胞或基因组数量 对样品量校正：目的基因数量/内标基因 内标通常选用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因 相对定量——通过 内标基因定量 2-ΔΔc(t) 法 双标准曲线法 相对定量方法: 2-ΔΔc(t) 法 公式推导 M:目标基因，N：内标基因 XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值) (1) XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2) 均一化 (1)/(2): X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-ΔC(t) X0M1/X0N1=2-ΔC(t)1 处理1 X0M2/X0N2=2-ΔC(t)2 处理2 处理2与处理1相比：? (X0M2/X0N2): (X0M1/X0N1)= 2-[ΔC(t)2-ΔC(t)1]= 2-ΔΔC(t) ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1) 理想PCR反应 每增加一个循环 产物增加一倍 N个循环2n倍 两个样品，C(t)值每相差1初始模板相差一倍 相差N，初始模板相差2n倍 比较两个样品差异的简单方法： 2 －ΔC(t) 2-ΔΔc(t) 法 目标基因 内标基因 ΔC(t) 样本1 C(t)M1 C(t)N1 ΔC(t)1 样本2 C(t)M2 C(t)N2 ΔC(t)2 ΔΔC(t) C(t)值与起始模板浓度成反比：2－ΔΔC(t) 当有多个样品时（如时间点），各样品