三基因工程的基本条件-基因载体PPT.ppt

Genetic Engineering;B 用于基因克隆的载体;在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子叫载体。; （1）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记，便于重组DNA分子的检测。;大肠杆菌的质粒;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;①根据质粒自身传递的性质分为： ;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;大肠杆菌接合（conjunction）;非接合型质粒：;;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。;严紧型质粒（stringent plasmid）;③根据可否引起宿主出现新形状分为： ;3. 质粒的不相溶性;实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： ;氯化铯密度梯度离心法： ;碱溶法： ;沸水浴法： ;（1） 具有复制起点（ORI）;;氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）; 常用抗菌素的抗性工作原理;ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）;a）杀菌原理;iv）链霉素（Streptomycin，Str）;v）四环素（Tetracycline，Tet）;;;② 遗传标记;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;7. 构建质粒载体的基本原则：;8. 质粒改造的主要方法：;9. 人工构建的质粒载体的类型;（2）低拷贝数的质粒载体;（3）失控的质粒载体;（4） 插入失活型质粒载体;（5）正选择的质粒载体;（6） 表达型质粒载体;复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS;;A. pSC101;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;;B. ColE1;;EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。 对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicin E1的频率很高！;;pSP2124质粒的Ampr基因;;;（5）pBR322的优点;外源基因?BamH I;氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy;保留了转移蛋白（mob）的作用位点。;① 删除mob识别位点;pBR325：;D. pUC系列;① 复制起点;;pUC18/19;Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。;?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。;③ lacZ的?肽互补;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;无质粒的 受体菌;;（5）pUC系列载体的优点;;由pUC派生而来。;① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA;G. 穿梭质粒载体;Yeast复制起点;（3）穿梭载体的优点;第三节 噬菌体载体 ;single linear DNA (about 182,000 bp);T4 Bacteriophage;分为两种：;;;感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。;;（1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）在两端有cos位点，可以环化。;?DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF－DNA）。;?噬菌体和其DNA;;? genome(48502bp);?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。;（2）滚环复制 ;;（1）构建原理：;? DNA如质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。; ; 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。;E基因突变;（3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型：;插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。;2）?-半乳糖苷酶失活型载体：;② 替换型载体