北京鸭肥胖基因克隆与分析.pdfVIP

中 文 摘 要 肥胖基因((obesegene，ob基因)是近年来克隆的一个基因，该基因产物 -Leptin是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子，对采食和能量消耗的 调节起着关键作用。Leptin能显著降低脂肪组织数量、促进青春期发育、调节生 殖机能、造血功能等。着眼于ob基因的开发和利用，本文利用RT-PCR技术克 隆了北京鸭的obcDNA，并与其他物种进行了同源性比较。 本实验用一步提取法从北京鸭脂肪、肝脏等组织中提取总RNA，参照小鼠 和人的共同序列，根据己经报道的鸡肥胖基因所编码的Leptin蛋白的cDNA序 列设计特异性引物，用RTPCR技术扩增出北京鸭ob基因，长约463by并进行 回收。将回收的ob基因片段与PUC18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受 态细胞，利用蓝白斑遗传学筛选方法筛选阳性克隆。对含目的片段的阳性克隆进 行细菌培养，从菌液中提取质粒DNA，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表 明PCR目的片段己经克隆到PUC18-T载体上，而且插入片段与目的片段大小 一致，表明成功地进行了北京鸭肥胖基因蛋白编码序列的克隆和筛选。 测序结果表明，北京鸭ob基因长463bp，编码135个氨基酸，1个开放阅读 框。对北京鸭和其它物种进行同源性比较，与人、鼠、猪、鸡、牛、羊的ob基 因序列同源性分别为81%,91%,81%,95%,83%和83%，在氨基酸水平的同源性 分别为67%,77%,62%,80%,65%,64%0 关键词:北京鸭 肥胖基因 LeptinRTPCR 克隆 同源性 MolecularCloningandAnalyzingofObese Gene(ob)inPekingDuck ABSTRACT Obesegene(ob)isageneclonedrecently.Itencodesaproteinhormone.The productofobgene-Leptinisanimportantsignalreflectingbodyfatmass andcontrollingweight.Itplaysakeyroleinthecontroloffoodintake andenergyexpenditure.Leptincanremarkably以‘downtheamountsoffatmass, stimulatedevelopmentoftheadolescence,regulatedthebeginningofprocreateand thefunctionofbloodmade.Toexploitandtakeadvantageoftheleptin，thePecking duckobesegenewasclonedandanalysisbyRTPCRandthealignmentofobgenein Peckingduckandsomeotheranimalswascontrasted. ThetotalRNAwasabstractedfromthePeckingduckadiposetissueandthe livertissue.Consultingthecommonsequenceofmouseandhuman,theprimerwas devisedonthesequencingdataofchickenmRNA.ThePeckingduckobgenewas amplified如RTPCRtechnology.Theduckobgeneis463bp.Retrievethefragment andlinkitwiththevector-PUC18.Transform thefragmentsintotheEcoli DH5ucell.Toscalpingthepositiveclonebyblueandwhitespotand abstracttheplasmidDNAfromthecell.Toelect护phoneplasmidDNAin1% agroseegel.Theresultindicatedthatthegoalfragmentshaveclonedtothevector. Theten沙 oftheinsertfragmentsissimilarlytothegoalfragments.Theseindicated thatthesuccessfuloftheclo