大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶分离纯化.pdfVIP

摘 要 大蒜含有丰富的超氧化物歧化酶 (SuperoxideDismutase,SOD)，超氧化物歧 化酶具有清除超氧自由基 (Oz一 功能，有效地预防Oz一对机体的毒害作用。本 研究采用热变性、聚乙二醇 6000(PEG)沉淀作用、DEAE一纤维素柱层析三种方 法对大蒜细胞溶质中的超氧化物歧化酶进行了分离纯化;利用改良的连苯三酚自 氧化法测定了酶活力，同时研究了酶对温度、pH的稳定性;并对酶的类型、在紫 外光区的吸收光谱等性质进行了研究。研究结果如下: 1.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶粗酶液中存在一种干扰酶活性发挥的物 质，该物质对热不稳定，而大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶对热较稳定，利用超 氧化物歧化酶、干扰物质、杂蛋白的热稳定差异，用热变性法进行初步分离。实 验表明在600C20min进行热变性，钝化了抑制酶活性发挥的干扰物质，并使酶液 中总蛋白浓度从24mg/mL下降到15.8mg/mL，得到比活为15.9U/mg的粗酶。 2.聚乙二醇6000(PEG)是一种水溶性非离子聚合物，可使蛋白质发生沉淀 作用，并且其对被沉淀的蛋白质有较好的选择性:当溶液中PEG的浓度为16%一 26%，上清液中超氧化物歧化酶活力保持不变;当PEG浓度提高至28%时，上清 液中酶活力开始下降，至PEG浓度为40%时，上清液中酶活力为零，表明酶液中 超氧化物歧化酶从溶液中完全析出，得到了比活为129.3U/mg的酶蛋白。 3.PEG沉淀后的酶蛋白经DEAE一纤维素(DE-52)柱层析，利用pH7.80.05mol/L 磷酸缓冲液 (PB)+1.0mol/LNaCl梯度洗脱，使超氧化物歧化酶蛋白和杂蛋白有 效地分开。层析最佳的条件是:流速为1.2mL/min、柱高比为1:10、进样量为6mL; 超氧化物歧化酶被完全被洗脱的时间为33min，洗脱体积为40mL，杂蛋白被洗脱 下来洗脱时1司为 “min，体积为80mL，表明DEAE一纤维素 (DE-52)柱层析具有 较高的柱效和分辨率，得到了比活为3145.5U/mg超氧化物歧化酶蛋白。 4.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶是一种对热和酸碱度稳定性较好的酶，低 于600C酶活力较为稳定，600C30min酶活力仅损失19.1%;高于700C酶活力损失 明显，700C30min酶活力损失56.6%,800C30min酶活力损失70.8%;pH4-9范 围内酶活力保持稳定，pH4和pH9时，超氧化物歧化酶活力下降明显，pH2.0 时剩余酶活力为21%,pH10时，剩余酶活力49.1%,pH=12时，酶活力完全损失。 5.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶对H2O:和氰化物敏感，经鉴定酶的类型是 CuZn-SOD;在紫外光区的最大吸收峰是258nm，表明其是含有酪氨酸和色氨酸 较少的一类酶蛋白。 6.经过三步分离纯化，从500g大蒜中得到15.6mg产品，比活为3145.5U/mg, 纯化倍数为197.8，回收率39.2%o 关键词:大蒜细胞溶质 超氧化物歧化酶 分离纯化 Abstract Allium SativumcontainsaquantityofSuperoxideDismutase(SOD) havingthe can prevent02-from functionofremovnigthesuperoxidefreeradical(02-),soit harmingtheorganism effectively.Inthisresearchthreemethodsareusedtoseparate andpurifySODfromAlliunSativum cellplasma，whichisthermodenaturation precipitationofPolyethyleneglycol(PEG)andthecolumnchromatographyof DEAE-cellulose.EnzymesactivityismeasuredwithimprovedPyragallolautoxidation, meanwhilethestabilitiesofenzymetowardstemperatureandpH,thetypeofenzyme andabsorptionspectru