免疫印迹法的实验技术PPT.pptVIP

② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在4℃进行）。 ③小心取出转移膜，做好标记，在1×TBST液中漂洗两次。 （用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全,用丽春红染色液膜,检测蛋白质是否转移到膜上.） 打开转膜夹板，由阴极侧 海绵垫片→3层滤纸→样品凝胶→ NC膜→三层滤纸（排除气泡）→海绵垫片阳极侧 LOGO 免疫印迹法的实验技术（Western Blot 印迹方法） 一、Western-Blot简介 Western Blot，又称为免疫印迹（Immunoblot）,是70年代末80年代初发展起来的蛋白质测定技术。 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。 实验主要内容： 实验用途 2 实验注意事项 4 实验方法及步骤 3 3 实验原理 3 1 实验原理 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶 【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离 → 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 → 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。 实验用途 用于检测样品中特异性蛋白质是否存在。 对特异性蛋白质进行半定量分析。 蛋白免疫印迹组成 凝胶电泳 1 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带 2 把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上 样品的印迹 3 用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原 免疫学检测 实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白含量→制备SDS胶→蛋白变性、上样→电泳→ 转膜→封闭→一抗→TBST洗膜→HRP标记的二抗→TBST洗膜→ECL底物显色→X光片曝光、显色→结果分析 二、蛋白样本的制备和浓度的测定 蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白的提取 组织蛋白提取 组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制-置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4℃离心，12000rpm，10min取上清分装1.5ml离心管中－20℃保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。） 蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具体情况具体选择。 注意事项 注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。 所用离心机需提前预冷。 为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。 蛋白浓度的测定 原因： Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量测定。 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。 方法： 目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford法）。 目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试剂盒. BCA法工作原理 BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂等影响小。 SDS电泳 SDS电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 原理 1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一