第九章讲义－外源基因表达.pdfVIP

第九章 外源基因的表达 生物有机体的遗传信息都是以基因的形式储存在细胞的遗传物质 DNA 分子上的，而 DNA 分子的基本功能之一，就是把它所承载的遗传信息转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白 质(包括酶)分子，从而决定生物有机体的遗传表型。这种从 DNA 分子有序地将其所承载的遗传 信息，通过密码子和反密码子系统，转变成蛋白质分子，执行各种生理生化功能完成生命的过 程叫做基因表达(gnee expression)。 在大肠杆菌细胞中，参与特定新陈代谢的基因是趋于成簇地集成一个转录单位，即操纵子。 在操纵子中，主要的控制片段，包括操纵基因和启动子，是位于它的起始部位。在基因表达过 程中，操纵子先转录成多顺反子 mRNA，然后再从多顺反子 mRNA 转译成多肽分子。为了使克隆 的外源基因能够在细菌寄主中实现功能表达，就必须使基因置于寄主细胞的转录和 mRNA 分子 的有效转译控制之下。而且在有的情况下，还涉及到表达产物蛋白质分子的转译后修饰的问题。 所以，并非所有的基因表达都是始终如一的，有些要受细胞内外环境的调节。 1974 年，A.C.Y.Chang 和 S.N.Cohen 证实，金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus)的 r amp 基因能够在没有亲缘关系的大肠杆菌中实现功能表达。在这一发现的激发下，人们期望与 遗传密码的通用性一样，从基因到表型的生化途径也应该是通用的。据此便设想，任何细菌的 基因也都应该能够在别种细菌中表达。随后，K.Struhl 等人(1976)和 D.Vaphek 等人 (1977) 又相继发现，两种比较低等的真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粗糙链抱菌 (Neurospora crassa)的基因也能够在大肠杆菌中表达。这样，便进一步增强了人们的此种想 法。基于这样的原因，研究工作者们纷纷推测，更高等的真核生物的基因也能够在细菌中实现 表达。随着基因工程研究的进展，现已能够掌握基本条件，做出正确设计，使克隆的一些真核 外源基因获得表达。在适宜的调节元件控制下，每个细胞能合成克隆基因的功能蛋白多达 20 多个分子，占大肠杆菌合成的可溶性蛋白量的 5%～40%。 此外，利用各种先进的基因导入技术及细胞培养方法已成功实现了外源基因在动、植物及 酵母等真核宿主细胞中的表达。利用真核细胞作宿主表达系统的优点是:①真核细胞能够识别 和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的 mRNA。也就是说含有内含子的天然基因在 真核细胞中是可以利用的，这是原核细胞办不到的。②真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠 杆菌表达的蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。但真核细胞作 宿主表达系统尚存在以下几个问题:⑴选择标记及选择系统只有少数几个；⑵转化效率低，一 般只有 10-6 -4 ～10 ；⑶外源基因转移并整合到细胞染色体 DNA 上带有一定的自发性和盲目性， 整合的拷贝数和位置都还不能控制；⑷细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时。此 外，细胞大量培养还有不少问题，而且成本较高，利用培养细胞方式大量生产某些表达蛋白， 从工艺到成本都要很好地考虑。 克隆基因表达方面的研究成果，对于某些研究领域有着重要的用途。首先，它有可能为揭 示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的研究手段。例如，运用重组 DNA 技术，能够获得可在 大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂种干扰素的编码基因。这样，便可以将这种蛋白质分子纯化 出来，在体外进行生物学方面的研究。这类工作进一步深入下去，可以用来检测体外突变所产 生的变异氨基酸在蛋白质多肽链中的位置，并测定出这种改变对于酶功能的效应。在实际的应 １ 用方面，基因克隆和表达技术也有着不可忽视的重要性。应用重组 DNA 技术产生的蛋白质，在 医药卫生、食品工业等方面的实用价值及前景也是十分诱人的。利用基因工程技术将真核基因 转至原核生物中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用传统和常规方法不能或难以大量生产 的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从 50 万只羊脑中仅能提取出 5mg，而现在用 1OL 的工程菌液即能提出来。用 720kg 猪胰脏只能 够提取出 1OOmg 胰岛素，而用 200OL工程菌发酵液即可得到同样量的胰岛素。用传统细胞方法 生产干扰素，产量低且纯度低，现在 1L 工程菌液可