基因工程(基因工程的主要技术与原理-核酸分离 电泳)PPT.ppt

2)??硅胶膜纯化法： RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似； 当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开； 在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来； （三）mRNA的纯化 Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库 时，则必须得到纯化的mRNA； 亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的 poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开 发出许多用于mRNA纯化的层析柱。 RNA电泳结果 28S rRNA 18S rRNA 三、核酸的评价 1.核酸纯度评价： DNA样品： OD260/OD280=1.8 较纯； OD260/OD2801.8 可能有RNA污染； OD260/OD2801.8 有蛋白质污染； RNA样品： OD260/OD280=2.0 较纯； OD260/OD2802.0 可能有异硫氰酸残存 ； OD260/OD2801.7 有蛋白质或酚污染 2.核酸浓度估算： 当OD260＝1时，?? ?? ? [SSDNA]= 37μg/ml [dSDNA]= 50μg / ml [SSRNA]= 40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg / ml (Nucleic Acid Gel Electrophoresis) 第二节 核酸的凝胶电泳 优点： （1）便于分离； （2）便于检测； （3）便于回收。 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一， 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段； 电泳：带电物质在电场中向相反电极 移动的现象称为电泳。 一、核酸凝胶电泳的基本原理 核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态； 核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移； 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、在凝 胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有 差异的核酸分子。 电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成 反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数； 一、琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis 检测DNA是否真的存在，是否有降解现象，DNA经 限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟 的检测 DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从 海藻中提取的一种线状高聚物，在0.7%的琼脂糖 浓度下，对0.8-10kb的DNA有最佳的分离效果。 （一）凝胶的制备及电泳 琼脂糖分子式 琼脂糖(Agarose)：是从红色海藻中提取的一种 线状多糖高聚体。 琼脂糖凝胶制作过程 （二）DNA的迁移速率决定因素 双链DNA分子迁移的速率 与其碱基对数的常用对数 近似成反比； 500 1000 10000 5000 同一分子：超螺旋环状＞ 线状＞缺口环状。 1.DNA分子的大小和构象 2.琼脂糖浓度和种类 浓度越低，相同核酸 分子迁移越快； 常见的有两种：标准 琼脂糖和低熔点琼脂糖； 5000 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型 凝结温度/℃ 熔化温度/ ℃ 标准琼脂糖 35-38 90-95 不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异 40-42 85-90 高强度琼脂糖 34-43 85-95 修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖 25-35 63-65 35 65 超低熔点 8-15 40-45 低黏性低熔点琼脂糖 25-30 70 38 85 30 75 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓 度（%） 标 准 (kb) 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶点(kb) 0.3 1~50 0.5 0.7~25 0.8 0.5~15 0.8~10 0.8~10 1.0 0.25~12 0.4~8 0.4~8 1.2 0.15~6 0.3~7 0.3~7 1.5 0.08~4 0.2~4 0.2~4 2.0 0.1~3 0.1~3 3.0 0.05~1 0.5~1 4.0 0.1~0.5 6.0 0.01~0.1 3.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷 减少、刚性和长度增加。 5.所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比； 6.电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE。 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） tris-乙酸 （TAE） 1×0.04mol/l tris-乙酸 50×242g tris碱 　 0.001mol/l EDTA 57.1ml冰乙酸 　 　 100ml 0.5