基因工程 第三章 载体PPT.pptVIP

（2）长度 4363bp （3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。 （4）克隆位点 其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 24个克隆位点。 （5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet其中之一中死亡。 外源基因?BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因?Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡 3. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 ① 复制起点 pBR322的 ori 但其上失去了克隆位点。 ② Ampr 基因 （1）元件来源 pBR322的Ampr基因 ③大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因； ④位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。 （2）长度 约2.7kb （3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。 pUC18/19 Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。 （4）选择标记 蓝白斑选择原理： ① Xgal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactoside） ?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 ?-半乳糖苷酶 ② ?-半乳糖苷酶Xgal显色反应： ③ lacZ的?肽互补 1）?-肽（ lacZ’ ）： ?-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 lacZ只有在4聚体的状态下才有功能. C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa 4聚体 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失?肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。 C端大部分 N端的11-41aa pUC lacZ’ 受体菌lacZ? 3）载体lacZ’与?互补 4）?互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位 点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成， 但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不 能互补。 lacZ’ 5’ 3’ ?肽移码突变 lacZ’ 5’ 3’ ?肽 不互补 互补 MCS 外源DNA ④ IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’?肽都表达。从而互补。 但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生?肽！ IPTG 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。 MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 IPTG诱导的结果： （5）pUC系列载体的优点 ① 更小的分子量： 如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。 ② 选择方便 Xgal显色、抗菌素双重直接选择。 ③ 克隆便利 具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 ④ 测序方便 第二节 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phage） T4 Bacteriophage 一、 噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒 1. 噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：无尾部结构的二十面体型、 具尾部结