基因工程4-1 基因工程的载体PPT.ppt

第四章 基因克隆载体;1. 定义：携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体（Vector）。 载体的本质是DNA。 ?2. 在基因工程中所用的载体，主要有5类： 质粒（Plasmid） 噬菌体?（? phage）的衍生物 柯斯质粒（Cosmid） 单链DNA噬菌体M 13 动物病毒;3. 理想的载体应具备的条件： 具有自我复制能力 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上 具有一个或几个选择性遗传标记 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数 可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中 容易从宿主细胞中分离纯化 ;4.1 质粒载体 4.1.1 质粒的一般生物学特性 1. 质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 它广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。 在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。 质粒分子的大小为1~200kb，它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中，依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制，并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达；同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。;2. 质粒的类型 (1) F质粒：又叫F因子或性质粒（sex plasmid）， F+、F- F+ ? F-，染色体标记低频转移，F因子高频转移 F质粒可以整合到染色体上，同步复制（这种菌株在与F-菌株杂交时，比F+所产生的遗传重组频率要高103倍），称为Hfr菌株（高频菌株）。 Hfr?F-，染色体标记高频转移，F因子低频转移 F因子从染色体脱离下来时，往往会带有染色体片断，这种带有染色体片段的F因子称为F’因子。;3. 质粒的分类 根据质粒能否自己转移，可分为： 接合型质粒：自我转移的质粒，除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因。 非接合型质粒：不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。;根据质粒的拷贝数，可分为： 严紧型质粒：拷贝数1~3份 松弛型质粒：拷贝数10~60份 质粒的复制型不是绝???的，不仅受自身的制约，还同宿主的状况有关。 ? 分子量大 分子量小 接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多 严紧型复制 松弛型复制 ?;4. 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这种现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。 彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群；而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。 不亲和群：来源于同一种原始质粒，利用相同复制系统的这类质粒。;4.1.2 几种常见的质粒 1. Col EI质粒载体 属于大肠杆菌Col类质粒中的一种，是一种天然质粒。大小为6.3 kb，含有EcoR I的单一酶切位点，具有松弛型复制子。 在培养基中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，宿主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止；而质粒DNA仍可继续进行数小时的复制，这样每个宿主细胞所累积的Col EI质粒的拷贝数可达1000~3000个。 Col EI质粒除了具有可以编码大肠杆菌素EI的基因外，还可以编码使宿主细胞对大肠杆菌素EI产生免疫性的基因。; 对大肠杆菌素的免疫特征可作为一种选择标记。若在Col EI质粒的EcoR I位点插入外源DNA序列，则宿主细胞不能合成大肠杆菌素EI（Col EI -），而具有EI免疫性（Imm EI +）表型的为含有重组质粒的细胞。 Col EI质粒的松弛型复制子几乎是所有人工质粒的组成单元。;2. pBR 322质粒载体 是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体。大小为4.3 kb，分子量为4.2?106dal。具有Col EI松弛型复制子，拷贝数为60个/细胞。 pBR 322质粒上有两个选择性标记： ? 氨苄青霉素抗性基因（AmpR）：其上有Pst I的切割位点 ? 四环素（Tetracyclin)抗性基因（TetR）：其上