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基因工程4-1 基因工程的载体PPT
第四章 基因克隆载体;1. 定义:携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体(Vector)。
载体的本质是DNA。
?2. 在基因工程中所用的载体,主要有5类:
质粒(Plasmid)
噬菌体?(? phage)的衍生物
柯斯质粒(Cosmid)
单链DNA噬菌体M 13
动物病毒;3. 理想的载体应具备的条件:
具有自我复制能力
有适宜的限制酶切位点,最好是对多种常用的限制酶有单一切点,并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上
具有一个或几个选择性遗传标记
分子量较小,在受体细胞内有较多的拷贝数
可携带足够长度的外源DNA片断,并能有效的转化至宿主细胞中
容易从宿主细胞中分离纯化
;4.1 质粒载体
4.1.1 质粒的一般生物学特性
1. 质粒:是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
它广泛存在于细菌细胞中,在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。 在基因工程中,多使用大肠杆菌质粒为载体。
质粒分子的大小为1~200kb,它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中,依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制,并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达;同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。;2. 质粒的类型
(1) F质粒:又叫F因子或性质粒(sex plasmid),
F+、F-
F+ ? F-,染色体标记低频转移,F因子高频转移
F质粒可以整合到染色体上,同步复制(这种菌株在与F-菌株杂交时,比F+所产生的遗传重组频率要高103倍),称为Hfr菌株(高频菌株)。
Hfr?F-,染色体标记高频转移,F因子低频转移
F因子从染色体脱离下来时,往往会带有染色体片断,这种带有染色体片段的F因子称为F’因子。;3. 质粒的分类
根据质粒能否自己转移,可分为:
接合型质粒:自我转移的质粒,除含有自我复制基因外,还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因。
非接合型质粒:不能自我转移的质粒,此类质粒能够自我复制,但不含转移基因组。从基因工程的安全角度讲,非接合型质粒用作克隆载体更为合适。;根据质粒的拷贝数,可分为:
严紧型质粒:拷贝数1~3份
松弛型质粒:拷贝数10~60份
质粒的复制型不是绝???的,不仅受自身的制约,还同宿主的状况有关。
?
分子量大 分子量小
接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多
严紧型复制 松弛型复制
?;4. 质粒的不亲和性
两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定地共存,这种现象称为质粒的不亲和性,也称不相容性。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群;而彼此能够共存的亲和质粒,则属于不同的不亲和群。
不亲和群:来源于同一种原始质粒,利用相同复制系统的这类质粒。;4.1.2 几种常见的质粒
1. Col EI质粒载体
属于大肠杆菌Col类质粒中的一种,是一种天然质粒。大小为6.3 kb,含有EcoR I的单一酶切位点,具有松弛型复制子。
在培养基中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成,宿主染色体DNA的复制便被抑制,细胞的生长也随之停止;而质粒DNA仍可继续进行数小时的复制,这样每个宿主细胞所累积的Col EI质粒的拷贝数可达1000~3000个。
Col EI质粒除了具有可以编码大肠杆菌素EI的基因外,还可以编码使宿主细胞对大肠杆菌素EI产生免疫性的基因。;
对大肠杆菌素的免疫特征可作为一种选择标记。若在Col EI质粒的EcoR I位点插入外源DNA序列,则宿主细胞不能合成大肠杆菌素EI(Col EI -),而具有EI免疫性(Imm EI +)表型的为含有重组质粒的细胞。
Col EI质粒的松弛型复制子几乎是所有人工质粒的组成单元。;2. pBR 322质粒载体
是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体。大小为4.3 kb,分子量为4.2?106dal。具有Col EI松弛型复制子,拷贝数为60个/细胞。
pBR 322质粒上有两个选择性标记:
? 氨苄青霉素抗性基因(AmpR):其上有Pst I的切割位点
? 四环素(Tetracyclin)抗性基因(TetR):其上
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