基因工程ppt03PPT.ppt

;载体的定义和作用;;;;图 3-1 带 pMB1（或 ColE1） 复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。;性质二:质粒的拷贝数;表3-1 质粒载体及其拷贝数 ;pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1，但其拷贝数较高。 pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ ，DNA聚合酶Ⅲ），依赖于DNA的RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、dnaD 和 danZ 的产物。 因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1） 复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2000~3000个质粒。 ;性质三:质粒的不相容性;不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。;;性质四:质粒的转移性;细菌的接合作用（conjugation） 通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。 雄性E.coli有性纤毛(也称之为伞毛)性纤毛可使其与雌性E.coli接合，质粒可通过纤毛从一个细胞转移到另一个细胞。;;3.1.2 标记基因;选择标记---转化载体的宿主的筛选;补充; penicillins ; 四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒：有氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因。 ; 氯霉素与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。 目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。 cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。;卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这???种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。 在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。;在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。 supE 基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰胺。;筛选标记-----重组质粒的筛选????;1.α-互补（α-complementation）;;大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 β-半乳糖苷酶。 lacZ△M15 基因是缺失了编码 β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。 只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ′) ，其产物也没有酶学活性。 这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。 △：deletion ;图3-2 lacZ和lacZ’多肽的结构关系（左） 和通过α-互补产生的菌落颜色变化（右）;在 lacZ ’ 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 β-半乳糖苷酶的功能内互补。 若在该 DNA 小片段中再插入一个大片段，导致产生无α-互补能力的 β-半乳糖苷酶片段。 利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。 在相应的载体系统中，lacZ△M15 放在F 质粒上, 随宿主传代； lacZ ’放在载体上, 作为筛选标记 。;乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。 异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物. 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal） 可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。 底物 X-gal 还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。 重组质粒，因互补作用遭到破坏，将显示白色菌落。;蓝白斑图示 请记住：什么是α-互补作用？ IPTG？