基因工程5-PCRPPT.ppt

第八章 PCR技术及其应用;DNA-------- 生命的蓝图;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成.DNA， ……;1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。;第一节 PCR技术原理和工作方式;;5’-GGTA……TCAT-3’ 3’-CCAT……AGTA-5’;;;二、PCR反应体系;;3、引物（primer）;Tm（解链温度）值的计算公式：;4、模板DNA;5、耐高温DNA聚合酶; Tth DNA聚合酶;; 高保真 DNA 聚合酶; Phusion 高保真DNA聚合酶 (Finnzymes );Phusion DNA聚合酶的结构示意图：双链的DNA结合结构域（紫色）被融合到一个新的类似于Pfu的酶上（绿色） ;;三、PCR反应程序;2、复性（退火）和延伸温度 3、反应时间 4、循环次数 5、PCR反应液的配制;;第二节 PCR产物的克隆;二、A/T克隆法;;? A/T 克隆法现在也有了新的发展， Invitrogene 公司开发了一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。从 Vaccinia 病毒来的拓扑异构酶Ⅰ可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键，释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5 羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将 DNA 连接起来。 pCR-TOPO 载体就是根据拓扑异构酶 Ⅰ 的这一性质来开发的， pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。;pCR-TOPO 载体的工作模式图;pPCR-Script Amp SK（+）克隆载体 ? 该载体从 pBluescript Ⅱ SK（+）噬菌粒改造而来，只是将多克隆位点中的 XbaⅠ和 SpeⅠ 位点改成 SrfⅠ 位点（GCCC / GGGC）。克隆 DNA 片段时，先将载体用 SrfⅠ切成线状，再与目标 DNA 片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加 T4 DNA 连接酶外，还加入 SrfⅠ 酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后， SrfⅠ 酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目标 DNA 片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标 DNA 片段连接这个方向倾斜。 ;pPCR-Script Amp SK（+）酶切与连接动态平衡示意图; pCR-Blunt 克隆载体??? pCR-Blunt 是另一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在 lacZ‘ 基因的下游融合了一个 ccdB 基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为 3.5kb ，含卡那霉素抗性基因和 Zerocin 抗性基因。在克隆外源平末端 DNA 片段时，先将该载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后， ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。;;第三节 PCR扩增未知DNA片段;1、反向PCR （inverse PCR）;反向PCR原理示意图;2、利用接头的PCR;3、热不对称交错PCR （thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）;;第四节 与反转录相关的PCR;一、cDNA末端的快速扩增 （rapid amplification of cDNA end，RACE）;;;二、差异显示PCR（Differential Display PCR，DD-PCR） ;基本原理：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly(A)尾