生物技术制药第三章 基因工程制药PPT.pptVIP

1、原核细胞-1 （1）大肠杆菌 大肠杆菌表达基因工程产物的形式：细胞不溶性表达（包含体）、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分泌到细胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且杂质的含量和种类也会变化。 大肠杆菌中的表达的特点：①不存在信号肽，产品多为胞内产物； ②分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性； ③不存在翻译后修饰作用； ④翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应； ⑤产生的内毒素难以除去； ⑥ 产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。 1、原核细胞-2 （2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响。 1、原核细胞-3 （3）链霉菌 其是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟。 2、真核细胞-1 （1）酵母 特点：①真核生物细胞，故有后翻译过程；②基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；④基因操作与原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。 在各种酵母中以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。 2、真核细胞-2 （2）丝状真菌 近年来，，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统，其特点是：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。 2、真核细胞-3 （3）哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。 哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 二、大肠杆菌中的基因表达 1、载体 表达载体必须具备的条件 （1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中拷贝数可高达3000个。 （2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。 （3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA酶所识别。 表达载体必须具备的条件 （4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。 阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，因而可人为地选择启动子启始转录mRNA的时机，以获得外源蛋白质表达合成的最佳时机。 外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。 表达载体必须具备的条件 （5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来还会影响质粒DNA本身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象，因此表达载体需在外源基因的下游安置一个强转录终止子，以克服由质粒转录引进的质粒不稳定。 表达载体必须具备的条件 （6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。 大家可以翻到书本73面，其中介绍了两个基因工程药物研究中常用的表达载体。 pBV220系统和pET系统。 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率：启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达效率。 （3）表达产物的稳定性：①组建融合蛋白；②利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽；③ 采用位点突变的方法；④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。如黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，减少了表达产物在细胞体内的降解。 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （4）细胞的代谢负荷 外源基因的表达产物