分析耐冬山茶最佳胚状体和胚性愈伤产生条件.docVIP

分析耐冬山茶最佳胚状体和胚性愈伤产生条件 ??? 耐冬山茶(Camellia japonica)系指分布于青岛地区的山茶野生种群或栽培群体,为山茶科山茶属常绿小乔木或灌木,作为第三纪残遗植物,此群体具有丰富的遗传变异性.耐冬山茶可耐-10以下低温,是我国北方地区珍稀的室外冬春两季开花常绿植物,观赏价值极高[1].目前耐冬山茶仅分布于山东青岛及附近岛屿,野生植株只有几千株,栽培植株数量也不甚多[2].对于这个古老、珍贵的观赏种群,在园林中应用越来越广泛,因此,扩大耐冬山茶的种质资源数量是目前育种工作的重点.组织培养技术是快速、高效繁殖山茶的重要途径.山茶组织培养的方式主要为外植体材料(芽、茎段、叶片和子叶等)的愈伤组织 直 接 和 间 接 诱 导等[3,4].耐冬山茶未成熟胚胚状体培养再生繁殖体系(也称体胚培养)是通过胚状体直接诱导或愈伤组织间接诱导,可在较短的时间内获得再生频率高的植株,成本低,有利于种质资源保存、大规模生产耐冬山茶及实现外源基因的遗传转化[5].相比直接诱导胚状体方式,通过胚性愈伤诱导的胚状体可形成数量较多的植株,其中胚性愈伤的形成是诱导胚状体的关键环节.本实验采用不同激素组合,对不同时期采集的耐冬山茶不同部位幼胚进行胚状体和胚性愈伤诱导,分析最适宜产生胚状体和胚性愈伤的条件,为耐冬山茶胚状体再生繁殖体系奠定基础. ??? 1 材料与方法. ??? 1.1 实验材料. ??? 实验所用的耐冬山茶植株栽植于青岛市植物园实验田内,2012年4月进行异花授粉,8~9月分别采集授粉后15周、17周、19周和21周的幼果,以剥除果皮和种皮后分段的幼胚作为外植体. ??? 1.2 培养方法. ??? 1.2.1 不同实验材料组合. ??? 授粉后13周左右,耐冬山茶幼胚基本成型,可以进行分段培养.为排除胚芽生长的影响,分别将授粉后15周、17周、19周和21周的幼果内幼胚去除上端胚芽部分,留取中段和下端部分,每部分再平均分成4块,接种于诱导培养基上进行培养.每瓶接种一类幼胚(4个小块),每类幼胚接种10瓶. ??? 1.2.2 不同激素配制组合诱导 培养基 的基本培养基为MS,附加蔗糖30g/L,琼脂粉8g/L.培养基配方以诱导胚状体为主进行设计,不同的激素组合如表1所示.培养基调pH至5.8,121灭菌20min. ??? 表1诱导耐冬山茶胚状体和胚性愈伤的激素组合. ??? ??? 1.2.3 外植体消毒和培养采来的幼果先用流水冲洗干净,再小心剥出种子,自来水冲洗干净后放入无菌水中.在超净工作台中,处理过的种子先用75%酒精浸泡20s,再用无菌水冲洗2遍,然后使用0.1%的HgCl2消毒浸泡7min,最后用无菌水冲洗5~6遍.将分段的幼胚接种于不同组合的培养基中,在培养温度为25、光照光强为2500~3000lx的培养室中培养,光照时间为12h/d.每7d观察一次,30d后统计产生胚状体和胚性愈伤的数量及产生胚状体/胚性愈伤的幼胚块数量. ??? 2 结果与分析 ??? 幼胚接种1周左右开始膨大,2周左右开始出现胚性愈伤,胚性愈伤呈现淡黄绿色,生长较一般的愈伤组织缓慢,质地松软,表面有瘤状凸起,细胞排列紧密.3周左右就能够区分直接诱导的胚状体和愈伤组织,此时的胚状体基本发育到子叶胚阶段,颜色为淡黄绿色或乳黄色(图1).在对出现胚性愈伤和胚状体的幼胚块进行统计的基础上,还进一步确定了产生这两类组织的具体数量.其中胚性愈伤根据耐冬山茶中诱导出现的形态特点,以组团为单位进行了统计. ??? ??? 2.1 授粉15周后的胚状体和胚性愈伤诱导 ??? 从表2可看出,对于胚状体诱导率最高的组合为1.0mg/L 6-BA激素培养基对于末段幼胚诱导和1.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA诱导末段幼胚,最低诱导率出现在添加1.0mg/L IBA激素培养基对中段幼胚的诱导组合中.在对胚性愈伤诱导中,诱导率达60%以上的激素配方和幼胚部位组合包括5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA诱导末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA诱导中段幼胚,1.0mg/L 6-BA对中段幼胚诱导率高达75%. ??? 表明,较低浓度的6-BA及其与NAA组合对早期幼胚胚状体诱导率效果较好,而6-BA与较低浓度IBA组合有利于胚性愈伤的诱导. ??? ??? 2.2 授粉17周后的胚状体和胚性愈伤诱导 ??? 授粉17周后采集的幼胚接种后,对于胚状体的诱导率最高的组合仍然是1.0mg/L 6-BA和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA对于末段幼胚的诱导,但总体数量较授粉15周后接种的幼胚增多(表3).添加1.0mg/L 6-B