脐血干细胞分化与应用1PPT.pptVIP

干细胞医疗论坛 “干细胞”的概念在数十年前就已有介绍，但是直到目前，仍然还无法从形态或表型界定干细胞，而只能根据其功能定义。 干细胞具有两种特定的功能。 增殖功能指干细胞具有自我更新能力，可以生成更多的干细胞； 分化功能则指干细胞能分化成为各种祖细胞，后者可以进一步分化成各种特定成熟细胞系。 因此，目前干细胞的最好界定方法是功能学法 。 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)被认为是最多能的干细胞群体 ，具有最大的发展潜能，对胚胎细胞或组织的利用还存在伦理学争议 。 成体干细胞。在许多成人组织中已经发现有多种干细胞群体存在，如骨髓中的造血干细胞，以及其他骨髓衍生干细胞(BMSC) 能分化为血细胞和多种组织细胞。为了避免潜在的伦理学问题，克服免疫不相容性，在未来的组织工程中自身成人干细胞可能成为理想的选择。 脐带血干细胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。 体外实验技术以识别干细胞表面标记物作为基础，如CD34、AC133、STRO-1和神经营养素受体p75等已经用于干细胞的纯化实验，包括细胞淘选、荧光激活细胞分类、免疫磁性选择和免疫吸附柱分离等。目前有证据表明，如果利用某种单一的标记物分子进行干细胞分离，而对不表达该标记物的新干细胞群体尚未充分研究，则不能完全肯定分离结果。例如，干细胞活性与CD34分子在细胞膜上的表达不完全相关，小鼠体内存在一大群“静默”干细胞，它们不表达CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人体内也发现存在类似的CD34阴性休眠生血干细胞。因此，在未来实验中应设计新的方案，以成熟细胞系的标记物作为细胞转移基础会更有效。 为了克服干细胞数量少的不足，众多学者已经在探索干细胞的体外扩增方法。 但是，如何在长期的扩增过程中使干细胞不分化而又保持其多系分化能力成为一大难题。在干细胞临床实际应用中，理论上认为需要一个无基质、无血清的体外系统，并用已知的细胞因子和生长因子维持。 白细胞介素-3(IL-3)、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(FL)具有非细胞系特异性的早期生血刺激作用，可用于脐血干细胞的增殖培养。 血小板衍生生长因子(PDGF)-BB和表皮生长因子(EGF)是最有效的人类骨髓衍生干细胞克隆生长支持因子 。 从人类发育中的脑皮层中已成功分离出神经前细胞，并利用表皮生长因子和纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)使其扩增。 进一步的研究，如系统性分析生长因子受体的表达，将有助于设计新的干细胞体外扩增培养方案。 细胞产生的具有生物学活性的小分子蛋白质。 产生和作用的高效性、多样性、瞬时性。 细胞因子的作用通过与细胞表面相应受体结合而起作用。 一般培养细胞中细胞因子的使用量为5ng~100ng/ml,有量效关系。 细胞因子间有协同作用、相加作用、拮抗作用 用于细胞增殖的细胞因子造血干细胞：Flt-3 ligand, SCF, TPO, IL-3, IL-7, IL-11树突状细胞：GM-CSF, G-CSF, IL-1beta, IL-4, TNF alpha神经干细胞：EGF, FGF-basic间充质干细胞：EGF, PDGF-AA胚胎干细胞：FGF-basic用于细胞分化诱导的细胞因子Activins, BMPs, Cripto-1, Dkk-1, FGF-8, GDFs, Lif, Nodal, Noggin, Notch, Shh, TGF beta, Wnts 造血干细胞 CD133、CD34等+ 间充质干细胞 CD13、29、44、105等+ SCF、CSF 、IL-3,6 等可刺激细胞扩增 采用密度梯度离心法和贴壁法分离 采用密度梯度离心法和免疫磁珠法分离 调整培养基偏酸性，1%pen-strep 不同诱导分化条件分化为不同细胞 脐血造血干细胞的含量等于或超过骨髓。造血谱系标记,如CD3、CD14、CD19、CD34、CD45 等呈阳性。在体外对脐血祖细胞进行培养,发现使用SCF 加G-CSF、 GM-CSF、IL-3、IL-6等作为刺激因子培养 ,细胞集落形成 增加,脐血中的造血干细胞有更大的潜在分化和增殖能力。 从脐血中分离出单核细胞,在体外培养,贴壁细胞形态表现为破骨细胞样细胞和间充质样细胞两种,间充质样细胞表达多种间叶祖细胞(MPCs) 的相关抗原( SH-2 、SH-3 、SH-4 、ASMA、MABl470、CDl3 、CD29、CD44、CD105) 。用含2 %和5 %较低血清浓度的条件下,脐血单个核细胞可分化成较为均一的间充质样细胞,并可以在数量上扩增的同时,保持其多向分化的潜能，在一定条件下可以诱导分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等。 采用MiniMACS分选系统分