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外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖影响 　　【摘要】　目的：探讨外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖的影响。方法：用脂质体介导的方法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人胃癌细胞系BGC-823，分为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组及未转染组三个组别。应用实时荧光定量RT-PCR、Western blot免疫印迹分别在基因和蛋白两个水平检测各组p21的表达情况，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞增殖能力，流式细胞仪分析细胞DNA周期变化，所有数据进行统计学分析。结果：p21waf1转染组p21waf1 mRNA和p21蛋白高表达（P 　　【关键词】　基因转染；　p21waf1；　细胞增殖；　胃癌 　　p21waf1为野生型p53激活片段（wild-type p53 activated fragment 1，WAF1），它为单拷贝基因，是一种非常重要的抑癌基因，也是目前研究热点[1]。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）家族成员，是细胞周期蛋白（cyclin）与细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）的广泛抑制剂，主要参与细胞周期调控[2]。已有研究证实，p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用[3-5]。因此，本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中，使其稳定表达后，来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。 　　1　材料与方法 　　1.1　实验材料　pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823（由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠），基因转染试剂盒（QIAGEN公司），Trizol试剂、DMEM-高糖培养基（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Takara公司），p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物及各自Taqman探针（由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供），鼠抗人p21waf1单克隆抗体（Santa Cruz公司），兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（QIAGEN公司）。 　　1.2　细胞培养方法　人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10％胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液，37 ℃、5％CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态，取对数生长期细胞进行相关实验。 　　1.3　基因转染条件和方法　参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞??分三个组，分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。 　　1.4　p21waf1 mRNA表达的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计：上游：5’-GGACAGCAGAGCACC 　　1.5　p21waf1蛋白表达的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，进行一抗（鼠抗人p21单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗）孵育和显色，曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。 　　1.6　细胞增殖能力的检测　各组均取对数生长期的细胞，采用经典的MTT法检测后，绘制细胞生长曲线，分析各组细胞的增殖能力。 　　1.7　细胞周期分布的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，各约1×106个细胞，加入终浓度70％冷乙醇，4 ℃固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase酶（2 mg/ml）于37 ℃水浴30 min，再加碘化丙啶（25 mg/ml）染色，4 ℃避光20 min，经尼龙网滤过后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。 　　1.8　统计学处理　采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，计数资料采用 字2检验，以P0.05）。各组p21waf1蛋白表达见图3。 　　3　讨论 　　据众多研究表明，细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一[6]。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统，其中Cyclin对CDKs有正性调控作用，CKI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用，对特定底物磷酸化，从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能[7]。p21waf1作为一种重