琼脂糖和聚丙烯氨凝胶电泳.ppt

琼脂糖和聚丙烯酰氨凝胶电泳 提 纲 电泳的基本原理和方法 影响电泳迁移率的因素 介绍几种常用电泳技术的原理、操作及应用 一、电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 二、主要方法 有支持物的电泳技术： 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶  不用支持体的电泳技术： 1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳  三、影响电泳迁移率的因素 1、电场强度 2、溶液的pH值 3、溶液的离子强度 4、电渗现象 5、温度的影响 6、支持介质的筛孔 1、待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 2、电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为：200V/20cm＝10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2～10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20～200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。 3、溶液的pH值 缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响。溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。 4、溶液的离子强度? 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。 另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 5、电渗 液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。 6、支持介质的筛孔 支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。 四、电泳分析常用方法 （一）醋酸纤维素薄膜电泳 （二）琼脂糖凝胶电泳 碱性琼脂糖凝胶电泳 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 脉冲场琼脂糖凝胶电泳 （四）等电聚焦电泳技术 （五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 （六）IEF/SDS双向电泳法? （一）醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 （二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质