[畜牧兽医]实验室检测常用技术.ppt

缓冲液 * 猪、山羊、绵羊、狗 1:12.5、1:25、1:50、1:100/加1:20抗原后为1:25、1:50、1:100、1:200 终浓度1:50、1:100、1:200、1:400 比浊管每次试验均需现配 特征为以单核细胞浸润、巨噬细胞释出溶菌酶体和淋巴细胞释出淋巴毒素等多种淋巴因子引起组织损伤。 肿胀和变硬，出现以肉芽肿为特点的反应。 * * ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。 * ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都饱和后，PCR就进入了平台期。 结果判定 第一次判定要求不加抗原的，不加或加抗原的阴性血清对照管，抗原对照管呈完全溶血反应。 初判后静置12h作第二次判定，要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血。 对照正确即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结果。 判定标准 0 ～40%溶血判为阳性反应 50% ～90%溶血判为可疑反应 100%溶血判为阴性反应（GB/T 18646-2002） 皮内变态反应试验 实验原理 机体受到某种抗原刺激时，导致T淋巴细胞活化、增殖分化成致敏淋巴细胞，使机体致敏，以后如再次接触相同的抗原，致敏淋巴细胞即释放出各种淋巴因子，一方面使机体表现特异性的细胞免疫，另一方面则发生迟发型变态反应。 结核分支杆菌PPD皮内变态反应 实验操作 注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，做好记录。 注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射0.1ml(含2000IU)。 注射方法：先以75%酒精消毒，然后皮内注射牛型结合分支菌素PPD，注射后局部应出现小疱，如对注射有疑问，应另选15cm以外的部位或对侧重做。 皮内注射后72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，做好详细记录。 对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h分别再观察一次。 结果判定 阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm。 疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm。 阴性反应：无炎性反应，皮厚差在2.0mm以下。 凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60d再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。（GB/T 18645-2002） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 概述 酶具有高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十、几百个底物分子发生反应，产生放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。 本法自上世纪70年代初期由Van weemen、Schuars及Perlmarn等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 原理 将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。 ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原。 实验的方法类型有多种，如双抗体夹心法、间接法、竞争法和捕获法等，虽然原理不尽相同，但实验特点和影响因素基本一样。 酶 抗抗体 酶标记 抗抗体 抗体 抗原 固相载体 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 间接法（抗-HCV等）示意图 双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图 固相载体 抗体 抗原 酶 抗体 酶标记抗体 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 4