chapter 05 基因工程操作的主要技术PPT.ppt

4-* Walter Gilbert Frederick Sanger 第五节 DNA测序技术 是对DNA?分子的一级结构的分析。 4-* 5.5.1 双脱氧链终止法 Sanger等1977年发明。 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 4-* 1. 原理 （1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。脱氧核糖的连接是以3’?5’磷酸二脂键。 （2）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 （3）通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 4-* 4-* 2. 技术要点 （1）制备单链DNA模板 就是待测序的DNA链。 ①不能有5’?3’和3’?5’的外切酶活性； ②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。 （2）特殊的DNA聚合酶 dNTP / ddNTP = 100 / 1 （3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP 时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。 4-* 4-* 基本原理： （1）将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记. （2）分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5‘ 端被标记的 DNA 片段。 （3）这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 Maxam-Gilbert 化学降解法测序 两种方法的比较： （1）Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 （2）Sanger 法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。 （3）然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝。 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 4-* 二、DNA序列的自动测定的基本原理和操作方法 基本原理 由英国剑桥分子生物学实验室生物化学家Sanger等人1977年创建的利用DNA聚合酶和双脱氧核苷酸末端终止法测序已成为现今自动测序的最佳选择方案。 4-* 2.2 其独特性在于： 带4种不同荧光染料的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，而替代了手工测序的同位素标记。 采用聚丙烯酰胺区分长度仅差1个碱基的单链DNA。 一个样品的4个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。 电泳之后，就可以通过全自动激光激发以及荧光检测而直接“读出”碱基顺序。 4-* 组成 包括电泳系统、激光检测装置、电脑、彩色打印机、DNA序列分析软件及DNA片段大小和定量分析软件。 该系统采用电脑单点控制整个DNA测序仪，包括电泳参数设置、数据收集、分析及结果输出。电脑可在电泳过程中对仪器运行状态进行同步检测，电泳结果可以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 4-* 4-* 4-* ②引物的长度 即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。 理论计算： 419=2.75?1011。 一般引物设计为长15—30bp。 4-* ③引物的碱基序列 5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。 template primer 4-* ④引物的碱基组成 尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力 避免连续相同碱基排列或内部回文序列 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 发卡结构 1） 2） 4-* 3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 4-* ⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。 适