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封 闭 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h. 抗体孵育 一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体 二抗的选择 HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获 得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. MMP-9 抗MMP-9的兔单克隆抗体（注意说明书上的应用种属和实验） 抗MMP-9的鼠单克隆抗体 抗MMP-9的兔多克隆抗体 HRP（辣根过氧化酶) AP（碱性磷酸酶） 大小 40kD 140kD 最佳酶活性 PH：5－7 PH：8－10 酶活和二抗特异性 好于AP 抑制剂 氰化物， 硫化物 叠氮钠 氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂 稳定性 零度以下稳定 零度以下不稳定 底物 很多 部分 动力学特性 快速 慢 价格 便宜 昂贵 发光底物 ECL 显色底物 TMB，CN，DAB NBT，BCIP，NBT/BCIP 两种常用检测酶系统的比较 一抗（抗β-actin兔多抗） WB： 1:1000-1:4000稀释 二抗（山羊抗兔HRP） WB：1:2000-1:10000稀释 One Step Western Kit (Rabbit)一步法快速WB试剂盒（兔源） CW2029 One Step Western Kit (Mouse)一步法快速WB试剂盒（鼠源） CW2028 节省常规WB的封闭、一抗孵育、漂洗、二抗孵育的过程 GoldCassette-HIS HIS 重组标签蛋白快速检测试剂盒 CW2005 GoldCassette-GST GST 重组标签蛋白快速检测试剂盒 CW2007 实验过程中不需要进行SDS和WB，即可判断基因是否得到表达。本产品尤其适用于重组蛋白表达工程菌和转染细胞的初筛(最低可检测到的融合蛋白浓度为10 ng/ml) 北京康为世纪生物科技有限公司 Beijing CoWin Biotech Co.,Ltd. Western Blot定义 Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相 载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 Fc Fab Ag 抗体是机体针对外界抗原产生的一种免疫球蛋白 抗体可以特异性的识别并结合相应抗原 Western Blot基于抗原与抗体特异性结合原理 Western Blot基本原理 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 Western Blot应用 Western Blot 主要步骤 蛋白样品制备 SDS转膜 抗体检测 显色或发光 蛋白抽提的基本方法 物理方法 反复冻融 机械搅拌 超声 研磨 酶解法 化学方法 自溶法 洗涤剂 总蛋白的提取 细胞总蛋白的提取 材料：293T细胞（5×106个） 试剂：Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 检测beta-actin，分子量43KDa 注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，加入PMSF，低温操作 取200ul细胞裂解液，加入2ul PMSF储存液，终浓度为1mM。 PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂 【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 细胞总蛋白含量测定 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 双缩脲法 灵敏度低 中速，20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋生成紫色络合物 硫酸铵、Tris缓冲液、某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 快速，5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 慢速，40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－