Western blot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验PPT.pptVIP

转膜装置： 1.缓冲液槽和盖 2.凝胶支架转印夹 3.电转印模块 4.Bio-Ice冷却装置 转膜后检测（本次实验可省略） 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗NC膜，换 水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 * * Western-blot 法检测大鼠肝组织清蛋白的表达 核酸分子杂交 (molecular hybridization) 利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来。 在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。 加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下复性，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 探针 (Probe) 带有标记的、并已知碱基序列的DNA或RNA片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测是否有同源序列。 待检测的核酸样品和同位素标记的杂交探针同时溶于杂交液中进行反应 把待检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应 液相杂交 固相杂交 硝酸纤维素(NC)膜，尼龙膜 Alwine于1977年建立。 用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。 Northern 印迹杂交  （Northern Blotting) Western Blotting 蛋白免疫印迹 是20世纪70年代末80年代初，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展而来。 Western-blot Western-blot 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来进行检测。 Western-blot 的一般流程 蛋白样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳 转膜 免疫检测 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色（ECL、DAB） 本实验操作步骤 一、样品的准备： 使用适当的裂解液裂解细胞或组织样品，提取蛋白。 选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性。 RIPA Lysis Buffer一种传统的细胞组织快速裂解液 本实验操作步骤 一、样品的准备： 组织匀浆的制备 大鼠肝组织100mg，放入8ml离心管中 加入RIPA 900μl，冰浴匀浆（超声） 匀浆后立即加入PMSF 100μl，转移至1.5ml离心管中 加入Complete液40μl，4℃离心，10000rpm，10分钟，收集上清液，－70℃过夜 4℃，10000rpm再次离心10min 取上清液分装，－70℃保存 另取少量上清液测蛋白含量 第二天 考马斯亮蓝法（Bradford法） 蛋白含量的测定及上样量的计算 考马斯亮蓝G-250 + 蛋白质 蓝 色 595nm H+ 操作： 空白管 标准管 测定管 蒸馏水(ml) 0.05 标准蛋白液(ml) 0.05 样品(ml) (适当稀释) 0.05 显色剂(ml) (5倍稀释) 3.0 3.0 3.0 混匀，静置10min，于595nm处，以空白管 调零，测定各管吸光度 计算： 蛋白含量(g/L)＝ 测定管吸光度 标准管吸光度 ×标准管浓度(g/L) 根据所求样品的实际蛋白含量，求得在20μl 总体积中的样品体积，保证每个样品的上样量 为80μg。 二、Western blot法检测肝脏清蛋白的表达 样品的处理 将分装好的样品从冰箱中取出，用RIPA进行稀释 （根据计算结果进行稀释） 16μl稀释液中加入上样缓冲液4μl，混匀 95℃水浴中煮5分钟，冷却后可上样 计算结果 组别 1 2 3 4 蛋白含量(g/L) 15.713 13.695 15.443 11.810 上样量(ul) 5.1 5.8 5.2 6.8 RIPA量(ul) 10.9 10.2 10.8 9.2 上样缓冲液 4 4 4 4 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) PAGE的原理： 丙烯酰胺（Acr）＋ 甲叉双丙烯酰胺（Bis） 过硫酸铵 四甲基乙二胺 （催化剂） （加速剂） 聚丙烯酰胺凝胶 连续系统 缓冲液pH值及凝胶浓度相同 不连续系统 缓冲液pH值及凝胶浓度不同 PAGE 分离胶 堆积胶 Acr 5-10%（孔径小）, pH 8.8 Acr 2-3%（孔径大）, pH 6.8 连续系统 缓冲液pH值及凝胶浓度相同 不连续系统 缓冲液pH值及凝胶浓度不同 PAGE 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 电荷效应 分子筛效应 电荷效应 各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率亦不同，负载电荷多的移动快