专题一 微生物蛋白质组学PPT.ppt

丙酮沉淀后对照，700mg 720 丙酮沉淀后对照，＞700mg 711 丙酮沉淀后感染 0.7mg 730 丙酮沉淀后感染 0.7mg 717 上样量不同 7.2 制备胶切胶与胶内酶解 1 切胶：用解剖刀将目的点切下，并将胶块切成1mm3大小的胶粒，置EP管中。 2 脱色：加入脱色液100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次洗至透明。 3 冻干：弃脱色液，将胶粒冻干。 4 酶解：加入15-20μL酶液（0.01μg/μL），置于4℃放置30min，待酶液完全被 吸收，弃多余酶液，补充酶解缓冲液（25mMNH4HCO3）15-20μL，使胶完全浸没。37℃保温15小时或过夜。（注：时间不要太长） 5 蛋白提取：吸出酶解液，移至新EP管，原管加提取液Ⅰ（5%TFA）100μL，40℃加热水浴45min时，超声3min左右，再水浴45min。吸出提取液与酶解液合并，然后向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右，吸出提取液与前液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。－20℃保存用于质谱鉴定。 8 质谱鉴定 样品－基质的准备与点靶： 冻干的蛋白样品用0.1% TFA溶解（一般2.5μL左右），然后在靶上点样。 ①Dried-Droplet法：饱和的基质溶液与蛋白质溶液混合（5000:1），0.5-2μL混合液点到靶体上。 ②Thin-Layer法：均一的基质层首先在靶体上形成，然 后样品加在其上。 ③先加样品，再加基质。 样品点0.8-1μL，可分多次点样。点完样品后，点基质0.6μL，一次点样即可。 ■ 全面分析了宿主细胞感染CSFV病毒后蛋白质的整体表达模式 。在对照和感染样品中，每块凝胶检测到1300多个蛋白点。在病毒感染后48 h，通过软件分析，满足T检验（P0.05）、至少有1.5倍以上的差异表达的蛋白点共有35个。 ■ 在显著差异表达的蛋白中，用串联质谱(MALDI-TOF MS/MS)共鉴定了21个蛋白点，其中上调表达蛋白16个，下调表达蛋白5个。根据差异表达蛋白的功能，，根据蛋白功能可以分为细胞骨架、细胞能量代谢、抗氧化应激、核酸复制/转录/翻译、蛋白加工、信号传导以及热休克蛋白等7个类群 。 9 PK-15 细胞蛋白质组分析结果 Infection Infection control Infection control Infection control Annexin 2 GAPDH control Result of Proteome analysis (PK-15 cells) ■ 感染与复制相关蛋白 膜联蛋白annexin 2 是一个钙依赖的胞质蛋白，能与胞膜结合。参与多种病毒的感染、复制、装配、出芽与释放。比如， annexin 2介导巨细胞病毒的感染；在人上皮细胞，annexin 2是呼吸道合胞病毒的受体; 巨嗜细胞annexin 2与HIV 1糖蛋白Gag结合，并且annexin 2下调表达可显著抑制HIV复制。 Annexin 2在CSFV感染细胞中上调表达，表明其可能对CSFV感染和复制发挥着一定的作用。 差异表达蛋白的功能意义 不均一核糖核酸蛋白（ hnRNPs ）是一类核RNA 结合蛋白，具有参与转录、mRNA运输与剪接、mRNA稳定性等功能。研究表明一些hnRNPs蛋白参与病毒的RNA合成和加工，比如，hnRNP A1参与丙型肝炎病毒（HCV）的复制，调节鼠肝炎病毒RNA合成，几种hnRNPs蛋白还参与人获得性免疫缺陷病毒（HIV）的RNA代谢和基因表达的调节 。 ■ 感染与复制相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 ■ 感染与复制相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 翻译延长因子1δ (EF-1δ)在感染样品中显著上调表达。真核翻译延长因子在几种病毒的复制和致病机制中发挥关键的作用。如与WNV、登革热4型病毒、HCV、HIV-1 、BVDV等病毒的结构蛋白或非结构蛋白相互作用，促进病毒的复制或抑制宿主细胞的蛋白表达。 ■ 细胞凋亡相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 糖酵解酶磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）上调表达、 三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）下调表达。除了能量代谢功能之外， PGAM的活性增强可抵抗细胞的氧化应激，促进细胞无限增殖； GAPDH是细胞凋亡的通用介导蛋白 ，与细胞凋亡有关 ， GAPDH上调表达会诱导细胞的凋亡。 抗氧化应激蛋白（PRDX6, thioredoxin- like）上调表达, thioredoxin和PRDX6在细胞中过量表达能够抵抗氧化应激，抑制细胞凋亡 。 以上凋