于杰-PCR课件PPT.ppt

聚和酶链反应 polymerase chain reaction 于杰;概述;DNA in the Cell;DNA Replication;PCR的发展历史 ;反应体系：模板DNA 、耐热的DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物（primer）、4种dNTP以及合适的缓冲液体系。 ;PCR基本过程;延伸（extension）：当反应体系温度升至72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起点的5ˊ 3ˊ DNA链延伸反应，形成新生DNA链。 以上三个步骤为一次循环。每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，经过30个循环后，理论上可使基因扩增达109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 ;;;;二 、PCR引物设计原则;两引物间不存在互补序列，尤其是3′端。 引物与非特异扩增区的序列同源性不超过70%。 引物3′端一定要和模板DNA配对。最佳是G和C配对。 引物5′端可以修饰。;三 、模板制备;模板制备方法 DNA模板制备：用Proteinase K及SDS裂解细胞，消化蛋白质。用酚/氯仿多次提取去除蛋白质，若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。 RNA模板制备：防止降解。;四 、PCR基本反应;以DNA为模板的反应：; PCR amplify target DNA;以mRNA为模板的反应;;2 以mRNA为模板的反应;PCR产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和—平台期 。（25个循环） PCR反应的自动化 ;五 、PCR反应条件的控制;底物浓度：dNTP各20 ~200μmol/L，过高可加快反应速度，但会增加错配和成本。 缓冲液：提供合适的酸碱度和某些离子。50 mmol/L KCl、 10 ~ 50 mmol/L Tris·HCl（室温PH8.4，72 ℃ 时pH7.4）。 镁离子：TaqDNA聚合酶活性需要镁离子1.5 mmol/LMgCl2;反应温度和循环次数 ① 变性温度90 ~97℃，时间30 ~45s ② 退火温度为引物的Ｔm-5，约45~55℃，时间30~60s ③ 延伸温度72℃，时间1~4min ④ 循环次数25~30;PCR condition (heat cycle);六、 注意事项;防止假阳性 阳性对照 阴性对照 试剂对照;七、PCR产物常用的鉴定方法;在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%???脂糖凝胶放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择，一般用1.5%～2%，电泳电压75V，待样品进行凝胶内距胶末端1cm时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。 由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng，其荧光强度与DNA含量成正比。 ;八、 PCR技术的主要类型;;;;;;;;;;(二) 实时PCR( real time PCR) 指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 两个重要的发现起着关键的作用: 在90年代早期, Taq DNA 多聚酶的5 ’核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,因此使得间接的检测PCR 产物成为可能。 此后荧光双标记探针的运用使在密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。 ;;定量步骤: ①确定CT 值(C 表示循环数Cycle, T表示荧光域值Threshold) ,即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数; ②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT 值后,从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。 每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,即起始拷贝数越多, CT 值越小。 ;;;Real-Time PCR 法 ;小结;(三) 原位PCR ( in situ PCR) ：在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。;(四)其他PCR技术 筑巢PCR（nested-primer PCR）：设计两对引物，先用外侧引物扩增，再用内侧引物扩增。提高P