双向电泳2d中文手册（原理和方法） 图文并茂实验必备.pdfVIP

概述 关于本手册 本手册旨在介绍高分辨率双向（2-D ）电泳的操作方法。 本手册共分七章： 第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。 第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程，重点介绍EttanTM IPGphorTM Ⅲ等电聚焦系统。 第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相pH 梯度（IPG ）胶条的第二向电泳的一般方法。 第四章介绍使用平板 Multiphor TM Ⅱ电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。 第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。 第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE ）的优势与使用技术。 第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关章节。 本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences 公司的产品，该公司现为GE Healthcare 公司的一部 分（下文均称 GE Healthcare ）。备选设备及照片见表 1。产品订购信息见第 155 页。 根据样本类型和研究性质的不同，本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。 双向电泳简介 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应 用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。 第一向步骤为等电聚焦（IEF ），即根据蛋白质的等电点（pI ）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷 基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋 白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋 白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。 双向电泳由 OFarrel （1）在1975 年首次建立。在最早的技术中，第一向分离使用的是含有载体两性电 解质的聚丙烯酰胺管胶，详见第 43 页2.1 节。 自从双向电泳技术一产生，人们就认识到其作为一种生物化学分离技术的重要性，但这一技术得到广 泛的应用还应归功于以下几个方面的改进： 由于采用了固相pH 梯度胶和Immobiline(tm)试剂（2 ），使第一向等电聚焦的分辨率和可重复性大 大提高。基于这项技术，Görg 及其同事们（3,4 ）开发出了目前所使用的双向电泳技术，用固相 pH 梯度代替了载体两性电解质产生的pH 梯度，并用带支持膜凝胶代替了管胶。关于此项技术的 优越性详见第 45 页2.2 节。 双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE ）首先由ünlü 等 (5) 于 1997 年提出，这项技术可更好地控制 系统误差，使研究人员能够发现具有统计学意义的生物变异的蛋白质表达。 双向电泳后的一系列自动化操控，如凝胶图像分析、斑点采集、胶内酶解、以及靶样本制备用于 质谱测定等，大大增加了蛋白质分析与鉴定的能力。 新的质谱技术的发展，使人们能够快速鉴定和描述极微量的多肽和蛋白质。 现在的计算机和软件功能更强大，价格更低, 可对高度复杂的双向电泳图像进行彻底的计算机分析。 Handbook 80-6429-60AC 1 现在人们已经掌握了大量生物体全部基因组数据，从而可以迅速识别编码双向电泳分离的蛋白质 的基因。 目前蛋白质序列信息正日新月异地增加，并在公共域名数据库中共享，一些组织，如人类蛋白质 组组织（HUPO ），正在推动各国间的合作，共同进行蛋白质组学研究。 斑点图像数据库和基因组序列数据库均可以简单、直接地通过万维网访问，可分别用来比对双向 电泳结果和分析序列信息。 双向电泳技术在蛋白质组学领域里得到了大量的应用（6,7 ），利用该技术可对一种样本中的许多蛋白质 同时进行系统化的分离、鉴定、定量。双向电泳在这一领域中的应用也正是因为其同时分离数千种蛋 白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋白质修饰，这是无法通过基 因组序列分析进行预测的。双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治 疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白质纯化等。本手册所介绍的双向电泳操作，采 用 GE Healthcare 公司所生产的预制IPG 胶条（Immobiline DryStrip 凝胶）。 本手册中使用的符号 此符号表示在特定情况下能够改善操作或提供推荐的一般性建议。 此符号表示应视为强制性的建议，