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生化技术Biochemical Technique上海第二医科大学检验系临床生化与生化技术检验;一.什么是生化技术？ 生化技术是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。;内容： 生物大分子的一般制备 分子生物学的基本操作;?分离纯化检测生物大分子 电泳 Electrophoresis  层析 Chromatography 离心 Centrifugation  检测 光谱分析法;二.生物大分子的一般制备法 体液： 直接分离生物样品  组织细胞：先破细胞?分离? 检测;生物大分子制备的四个阶段;（一）材料选择和预处理：微生物 植物 动物;（二）组织细胞破碎的方法：1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer);研钵（加净砂或玻璃粉）;高速组织捣碎器 ;超声波; 渗透压法 反复冻融法;2.化学方法 有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层）3.酶法 自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的 ?-1，4-糖苷键）;（三）生物大分子的分离、纯化 以蛋白质为例【提取】相似相溶1.水溶液的提取 中性盐溶液提取： 缓冲液提取：2.有机溶剂提取;【分离纯化】1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法：（1）盐溶与盐析 （Salting in Salting out) 蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。; 当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。 ;盐析作用的产生?由于盐离子同水分子发生水合作用，  造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子，  减弱了蛋白质的水合程度。?蛋白质表面的电荷被盐溶液中对应的 离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋 白质等的溶解度下降，蛋白分子相互 聚集而沉淀析出。; 中性盐的选择 ?硫酸铵 (NH4)2SO4   ?硫酸钠 Na2SO4 ; 例：分离球蛋白和白蛋白 血清1ml  1ml PBS充分混合。 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液至50%，边加边搅拌。  离心  上清 沉淀（球蛋白）;（2）等电点沉淀法（溶解度最小） PI MW Alb 4.86 66 000 α1 5.02 130 000 α2 5.02 200 000 β 5.12 1 300 000 γ 6.8~7.3 1 500 000;（3）低温有机溶剂沉淀法△甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低 并析出。 △脱水、介电常数小△分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在 低温下进行。 （4）聚乙二醇沉淀法;2.根据蛋白质分子大小不同的  分离方法：;（1）透析和超滤  （Dialysis Ultrafiltration)透析： 利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。超滤（反向渗透） 利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。;（2）凝胶层析法（Gel Chromatography) 利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。（3）SDS;3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法： 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳离子交换层析法;醋酸纤维素薄膜电泳 血清蛋白质的分离 分子量 pI白蛋白 66000 4.86α1球蛋白 130000 5.02