抗体工程,蛋白质工程PPT.ppt

选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。 一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白序列之间插入外源基因：人Ig基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白pⅢ 或pⅧ的基因连接形成融合基因。 2．噬菌体表达载体的构建 一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人 Ig 基因片段多位于噬菌体基因的上游5ˊ端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是经过改建的，即含有LacZ启动子、核糖体结合位点(SD序列)、前导肽序列(保证分泌)和多克隆位点等，其后为M13外壳蛋白(pⅢ或pⅧ)。 噬菌体抗体图示 3．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达 表达出的人Ig片段位于噬菌体外壳蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号肽引导下到达质周腔，Ig片段在此能自发折叠成天然状态，恢复生物活性。 同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体分子蛋白处于其N端，分布在噬菌体表面。 抗体库的构建 4 单链噬菌体有效筛选 抗体库建立后, 用可溶性抗原去筛选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选率很低。需要改进和提高产率。 制备固相化抗原柱 人体内是通过抗原的提呈作用，选择表面呈现特异抗体的B细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不同亲和力抗体。 为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。 抗体库噬菌体过柱 选择目的抗体 把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的噬菌体是具有感染性,表面所带抗体是所需的特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。 6．洗脱结合的噬菌体 选择合适洗脱条件，把结合的、也是所需的噬菌体洗下来，收集噬菌体，再去感染细菌进行扩增。 经过这样一来一轮淘筛方式， 就能把抗体库中与抗原特异性结合抗体选出来，且能够做到富集。 抗体库的富集筛选 7．重复“吸附—洗 脱—扩增”过程 由于每径过一轮淘筛，可富集20～1000倍，几轮后很容易扩增到108个噬菌体体库。 （二）应用 1．应用“万能库”,制备人源抗体、多功能抗体 不经免疫已获得许多人的抗半抗原、 蛋白质、多糖及病毒等抗体。 2．抗感染：传染病诊断、治疗和预防(当 前重点、热点)。 3．抗肿瘤：肿瘤和其他疾病的导向治疗和 基因治疗。 4．利用抗体信息设计药物。 5．噬菌体表位文库， 可用此表达系统表达特异多肽后， 建立肽库（peptide library）。 蛋白质工程 (protein engineering） 蛋白质的结构及其多样性 ①氨基酸种类不同，肽链结构不同 ◇-◇-◇-◇-◇-◇-◇-◇-◇-◇ ◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎ 蛋白质多样性原因 ②氨基酸数目成百上千，肽链结构不同 ③氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同 ☆-☆-○-◎-◇-▲-△-●-□-◎-○-★-■-◇-★-◆ ●-■-◎-○- ☆ -○-☆-□-◎-▲-★-◆-◇-★-◇- ④肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同 天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。 满足人类生产和生活的需要 改造 干扰素（半胱氨酸） 体外很难保存 干扰素（丝氨酸） 体外可以保存半年 玉米中赖氨酸含量比较低 天冬氨酸激酶 （352位的苏氨酸） 二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺） 改造 改造 天冬氨酸激酶（异亮氨酸） 二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸） 玉米中赖氨酸含量可提高数倍 改造 例如．胰岛素改造　 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。 　 二、蛋白质工程的基本原理 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。 对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？ 蛋白质