植物细胞培养的基本技术PPT.pptx

第五章 植物细胞工程制药第四节 植物细胞培养的基本技术 植物细胞培养技术的基本技术： 一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择一、植物材料的准备1、外植体外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。来源：（1）、生长健壮在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。原因： a、代谢旺盛 b、再生能力强（比较容易培养成功）（2）、不同部位 ：靠近植株的近基部比较易成功。 选取：建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大:易污染，也不需要；材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm——1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。用于植物组织培养的外植体最重要的是无菌植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。培养前要进行严格的灭菌处理。无杂菌材料来源：种质库（种质库是用来保存种质资源（一般为种子）的低温保存设施。国家种质库是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。）国家种质库外景国家种质库长期库内景一、植物材料的准备2、外植体的消毒污染的原因 污染：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 （1）、从病源菌方面来分析主要有：细菌真菌（2）、从污染的途径而言主要是：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂选择灭菌剂的原则： （1）、 灭菌后易除去或易分解；（2）、 敏感的外植体的灭菌时间不宜过长不敏感的外植体的灭菌时间应适当延长常用灭菌剂的效果比较氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难，且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物细胞。氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌时，可延长到20min或更长时间。植物材料灭菌后，即可进行培养二、培养基及其组成培养基是“无菌土壤”，营养成分可以根据代谢特点进行调控。常用培养基MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、White等。MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。培养基成分 （1）、需要 大量无机盐 （2）、需要 碳源 （3）、需要 植物生长调节剂 （4）、需要 有机氮源 （5）、需要 维生素（1）需要大量无机盐根据无机离子在细胞内的作用分为四大类：1、大分子的结构成分：主要是C、H、O、N、P、S等；2、各种酶反应所需的主要离子，包括Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、Cl－等；3、各种酶活性所需的基础微量元素，包括：Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+等；4、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、铯、溴等。无机盐有大量元素和微量元素之分大量元素：使用浓度大于30mg/L的无机元素包括N、P、S、K、Mg、Ca、Cl和Na微量元素：使用浓度低于30mg/L的无机元素、如Fe、B、Mn、I、Mo（钼），以及极微量的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、Co或Al（2）需要碳源常使用的碳源：糖类、肌醇有时也用甘油等物质代替（3）、需要植物生长调节剂植物生长调节剂：是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括人工合成的具有天然植物激素相似作用的化合物和从生物中提取的天然植物激素。到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种植物激素： 生长素（最早被发现的植物激素） 分裂素 赤霉素 脱落酸 乙烯生长素：用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。组织培养中常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）：第一个被发现的内源激素，是最先被人工合成的生长调节剂二氯苯氧乙酸（2,4-D）萘乙酸（NAA）吲哚-3-丁酸（IBA）萘氧乙酸（NOA）对氯甲苯乙酸（P-CPA）NAA、IAA、IBA易引起生根2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素：主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：6-苄（biàn）基嘌呤（BAP）6-苄基腺嘌呤（6-BA）激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素（zeatin、zt）异戊稀氨基嘌呤（2-ip）植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例高浓度