生物大分子的分离纯化及其应用20120508PPT.ppt

6.1 反相高效液相色谱 分离机理 蛋白质的反相色谱中： ①用非极性的反相介质为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。 ②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。 ③在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。 ④不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大,出峰迟;疏水性小的蛋白质就容易被洗脱。 （RP-HPLC） 图 1 人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离 e.g: 其分离蛋白质和酶等生物大分子具有速度快、分离性能好，重复性好，溶剂和流动相易除去等优点。 在所有的液相色谱法中反相色谱的分离性能最好。 但最大的缺点是很多蛋白质或酶在分离过程中失活，而且回收的样品中总含有有机溶剂。 6.2 离子交换色谱 是最早被用于蛋白质分离的一种方法,其是根据蛋白质分子在一定pH和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。 其原理为以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。 (IEC) 这种技术已经成功地应用于分离大多数的水溶性蛋白质，还广泛用于大豆多肽的分离纯化。由于大豆多肽在一定pH和离子强度条件下带电有微弱的差异，和离子交换剂靠静电力结合在一起时，进入介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子就会发生交换的差异而分离。 离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两大类： 采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时，一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分离骨桥蛋白时，纯度可以达到85 %以上。 对于乳品中一些等电点较高的蛋白质，如乳铁蛋白，采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效。 6.3凝胶过滤层析 凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 * * * * * * 生物大分子的分离纯化及其应用 cly Biomolecule 生物分子 泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。 包括 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等） 小分子（如脂类、激素、维 生素等） 生物大分子 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。 常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 一般分子量从几千到几百万。 它们广泛存在于各种生物体内，与各种生命活动息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养和发酵的。 生物大分子具有十分重要的生理功能和应用价值。研究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科学的一个关键问题。 不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程 制备的生物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离和纯化。 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。 根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。 （1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备； （2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响； 生物大分子的分离纯化有以下主要特点： （3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经