第08章 基因工程和基因组学PPT.ppt

制作：王洪刚 李斯深 （2）核酸分子杂交——Southern杂交 (Southern blotting) ◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号 。 ◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。 ◆SOUTHERN.EXE （2）核酸分子杂交——Southern杂交 (Southern blotting) （4）核酸序列分析 ◆测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。 ●同源性比较。可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNA Data库的网址上比较，明确测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。 ●分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。 ◆对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。 (二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 ◆聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 。 ◆ PCR反应包括三个步骤： ●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。 ●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃ ●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链 ◆ 这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。 ◆PCR.EXE (三) 人工合成基因 ◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。 ◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列(图9－16)，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段。 目的基因与载体连接(DNA分子重组) DNA分子重组 目的基因导入受体 五 基因工程的应用 (一)基因工程工业 ◆在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前体胰岛素，再加工成两条不同的成熟胰岛素原分子，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。 (二)植物基因工程 1. 根癌农杆菌介导的植物转化 ◆植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。 ◆根癌农杆菌介导的植物转化 ◆除草剂glyphosate，是通过抑制叶绿体中的EPSP合成酶而杀死杂草的。如果EPSP合成酶遭到glyphosate的破坏，会使一些关键氨基酸的合成受阻，导致植物枯萎、死亡 ◆利用从抗glyphosate的大肠杆菌中分离、克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂glyphosate转基因植物。 2. 基因枪转化技术 ◆通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。 ◆这种转化方法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。基因枪技术还用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。 (三) 转基因动物 与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。 ◆例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。 ◆将人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(每升35克)，这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。 (四) 遗传疾病诊断 RFLP 法 RFLP 法 (四) 遗传疾病诊断 2. 等位基因特异寡核苷酸法 (五) 基因治疗 ◆利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(ge