第09章 基因工程和基因组学PPT.ppt

第九章　基因工程 和基因组学;1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。;1973年，美国斯坦福大学医学院的Cohen教授及其同事把抗四环素基因插入大肠杆菌质粒DNA后，组成一个重组DNA，结果发现这一个重组DNA能在大肠杆菌中复制,并具有抗四环素遗传表型。;1974年,Cohen教授和加州大学的Boyer教授，将非洲蟾蜍的rRNA结构基因插入大肠杆菌质粒DNA，再转化入大肠杆菌，结果发现非洲蟾蜍的rRNA结构基因得到表达。;1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基 因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。;广义遗传工程包括: 生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工程及酶工程等。;１.概念：;;3．内容：;一般而言，一个基因 ?是编码一条多肽链的 一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。;㈠ 从基因库中分离基因：;① 核基因库：;构建文库可采用不同的载体： ;;;② 染色体基因库：;果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割， 构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线 染色体带的分析。;人类基因组项目研究中， 利用流动细胞分离(flow cytometry)技术将人类染 色体分开，用于构建单 个染色体基因库，大大 加速了人类基因组作图 和分析。;酵母菌：;③ cDNA库：;mRNA;2.cDNA第二链的合成 ;DNApol dNTPs;dCTP; cDNA库与核DNA库不同：;2.筛选基因库：;密集铺板（1-10万）;筛库过程：;①. 限制性酶图谱：;限制性酶图谱构建方法(15kb); 用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性?来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。;②. 核酸分子杂交：;Northern杂交分析：用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。原理和程序与Sorthern杂交相同。;③.核酸序列测定;5?;在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：;④. 核酸序列分析：;（1）同源性比较 将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基 因间的同源性，将序列发送到Genbank等DNA Data 数据库进行比较。;;;;;;; GmMYBZ2; GmMYBZ2空间结构预测 （CHPmodels-2.0服务器 ）;（三）PCR扩增基因：;DNA模板;变性;基本要素;（四）人工合成基因：;化学合成的寡聚核苷酸 (80-100个核苷酸)?通 过SOE将单链部分补齐；;1.限制性内切酶(restriction enzyme)： 一类能识别双链DNA分子中一段特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 ;2.限制性内切酶的命名：;3.限制性内切酶的类别：;4.第Ⅱ类核酸内切酶特性：;对靶序列的切割：;(2)产生粘性末端(sticky end)的切割;;同裂酶:来源不同但可识别相同核苷酸靶序列，产生同样的切割并形成同样末端的限制酶。如HpaⅡ和MspⅠ均可识别CCGG。;载体：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。; 载体的条件：;（一） 细菌质粒：;pUC18质粒具有以下特点：;a-互补：指来自细菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的一段氨基酸残基(a-肽)，在与 a-肽缺失的b-半乳糖苷酶混合后，能够回 复lacZ酶活性的一种基因内互补现象。;基因组全长49kb。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。; 优点：;（三）柯斯质粒(cosmid)：;这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的 外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有 用。;（四）细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC);（五） 酵母人工染色体(YAC)：;指能在两种不同的生物中复制的载体。;穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中用于基因表达分析。　　; pCAMBIA2301载体;;（七）Ti质粒及其衍生载体：;Ti质粒一部分DNA叫转移DNA (transfer DNA，T-DNA)，当农杆 菌感染植物时，T-DNA便转移 到植物的染色体上，诱导冠瘿 瘤，并能合成冠瘿碱(opine),作 为农杆菌的碳源和氮源。;;;; 目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系 列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农 业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了 巨大的财富。;㈠ 基因工程工业 ;胰岛素的人工生产; 有些真核细胞的蛋