第6章 沉淀反应(kyhs)PPT.ppt

第六章　沉淀反应 ;抗原抗体反应类型;沉淀反应（precipitation）;1898年Kraus　　 毒素－抗毒素的沉淀现象 1905年Bechhold　沉淀反应可在凝胶中进行 1946年Oudin　　 试管免疫扩散技术(定性) 1965年Mancini　 单向免疫扩散技术(定量) 20世纪70年代　免疫浊度法(进入自动化阶段); 第一节　沉淀反应的特点 第二节　液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定 环状沉淀试验 标记免疫技术 第三节　凝胶内沉淀试验 单向扩散试验 Oudin Manicini 双向扩散试验 Okley Ouchterlony 免疫电泳技术 第四节　沉淀反应的应用;沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物 经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法 免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法 现代免疫技术（如各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术　;第二节　液体内沉淀试验;一、絮状沉淀试验;1.Ag稀释法（Dean-Webb法）;表1　Dean-Webb定量沉淀试验(以牛血清白蛋白为例的实验结果) (mmol/L);2.Ab稀释法――（Ramon）法;3.棋盘格法;表2　方阵最适比测定;二、免疫浊度测定(immunoturbidimetry);经典的沉淀试验有4个不足之处 操作繁琐 敏感度低（10～100μg/ml） 时间长 难以自动化;70年代出现了微量免疫沉淀测定法 免疫透射浊度测定 免疫散射浊度测定法 免疫胶乳浊度测定 这3种技术皆已常规用于多种临床体液蛋白的检测，并已创造出了多种自动化仪器;免疫浊度测定; 免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种 透射比浊仪测定（transmission turbidimetery measure） 散射比浊仪测定（nephelometry measure） 透射比浊法 1959年 Schultze 透射光线减少，光线被IC吸收 散射比浊法 1967年 Richie 检测散射光的强度;透射比浊法是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示 散射比浊法是测量入射光遇到质点（复合物）后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示 ;;浊度测定的弱点;影响免疫浊度测定的因素;1．抗原抗体的比例;;2．抗体的质量;3．抗原抗体反应的溶液;4．增浊剂的使用;免疫胶乳浊度测定法;免疫胶乳浊度测定法基本原理;;技术关键;免疫速率散射浊度测定法;速率散射比浊测定是一种Ag、Ab结合的动态测定法 经典的沉淀反应皆在抗原抗体结合完成后进行复合物的定性或定量测定（终点法）若在Ag、Ab反应的最高峰（约在1min内）测定其复合物形成的速率（速率法），则可达到快速、准确的目的;三、环状沉淀试验;环状试验中Ag、Ab溶液须澄清 用于鉴定微量抗原 法医学中鉴定血迹、流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原、细菌多糖抗原等 因该技术敏感度低，且不能作两种以上抗原的分析鉴别，现已少用;;第三节　凝胶内沉淀试验;原理：利用可溶性Ag和相应Ab在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在Ag、Ab浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环 适宜浓度的凝胶可视为一种固相的液体，水分占98％以上，凝胶形成网络，将水分固相化。 Ag、Ab在凝胶内扩散，犹如在液体中自由由运动;根据Ag、Ab反应的方式和特性，可分为 单向扩散试验 双向扩散试验 ;一、单向扩散试验;（一）试管法;如果溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带;抗体类型的区别;测定范围：;（二）平板法;; 由于试验中抗原向四周扩散， 故又称单向辐射状免疫扩散 （single radial immunodiffusion, SRID） 沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系 IC沉淀物还与分子量和扩散时间有关;抗原含量与环径的关系有两种计算方法 Mancini曲线 Fahey曲线;1．Mancini曲线;Mancini曲线 T1为16～24h T2为24～48h T3为48h以上 T3为直线 T1为反抛物线;2．Fahey曲线;Fahey曲线 t1为16～24h t2为24～48h t3为48h以上　　 t1为直线 t3为抛物线 ;采用SRID定量测定蛋白质浓度的条件;最初常用于临床检测 IgG IgA IgM C3 C4 转