第五章-基因组测序技术PPT.ppt

第五章 基因组测序技术;一些主要模式生物基因组测序概况;一些主要模式生物基因组测序概况;一、测序流程 1.构建生物基因组文库或cDNA文库 DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛选鉴定→扩增培养。 2. 从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序： 将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段 3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。;二、DNA测序的方法 双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序;Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链； ②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。 在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5→3外切酶活性。;2.技术路线与要求;5ˊP;;;（二）Maxam-Gilbert的化学降解法;2 技术路线;Maxam-Gilbert测序法的特异断裂;Maxam-Gilbert 法所用的化学技术;5ˊP;;化学法测序实例;改进的特异化学切割反应;（三）自动化测序;;（四） 非常规测序 1. 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 2. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. ;3. DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位??发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. ;利用基因芯片进行杂交测序的原理 ;三、测序及序列的组装的策略;A;实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装; 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ↓ ↓ ; 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况.;（二）限制测序;（三） 指导测序与序列组装; 先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.;两种策略的比较;（四） 其他测序路线;2. EST (Expressed sequence tag) 测序 EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从 cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列. 优点: A mRNA 可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比较容易构建; B 对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列; C EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;;四、人类基因组计划;1. 人类基因组计划的目的;2. 人类基因组草图的完成;二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成;美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。 ;人类基因组草图基本信息;2000年6月公共领域测序计划工作框架图;2001 年2月16日 人类基因组“精细图”完成，(99%), 2003年4月14日 人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%），提前绘制成功; A. Celera Genomics 人类基因组的测序策略 ;