第六章 端粒与端粒酶2010PPT.ppt

抑制端粒酶活性　——阻断端粒酶RNA的模板作用 端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的。 消除端粒自身模板作用的方法： 反义核苷酸封闭hTR 反义肽核酸封闭hTR 锤头状核酶切割hTR序列 反义核苷酸封闭hTR　　 端粒酶 RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成； Feng等首先用含反义hTR的质粒转染HeLa细胞,经过23～26倍增时间后，HeLa 细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。 反义核苷酸封闭hTR 为了提高抗反义核酸降解和进入组织细胞的能力， Piytts 等设计了一种甲基化的反义 RNA（ 2’-O-methyl-RNA ），用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97%； 有学者发现，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，诱导细胞凋亡。 反义肽核酸封闭hTR　 肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子； PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接； PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性。 PNA与DNA结构比较 骨架由 N-（ 2-氨基乙基）甘氨酸构成 碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸氨基连接 PNA对DNA或RNA的亲和力较相应DNA与DNA 和 DNA与RNA之间的亲和力高 在100mmol/L NaCl 溶液中，每碱基的Tm值约升高5℃； 导致PNA-DNA双链和PNA-RNA双链的Tm值升高的原因是由于 PNA-DNA和 PNA-RNA 中两条单链之间缺乏静电排斥力； PNA-DNA 和PNA-RNA双链的方向可以是同向平衡，也可以是反向平衡，反向平衡时Tm值更高。 不同盐浓度对杂交分子Tm值的影响  NaCl浓度 PNA/DNA DNA/DNA0 mmol/L 72℃ 38℃ 140 mmol/L 69℃ 56℃ 1000 mmol/L 65℃ 65℃   反义肽核酸封闭hTR PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力； Norton等，设计了针对hTR模板区的不同长度的PNA，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强； PNA的高度亲和性、高度特异性和抗降解能力，使之成为极具潜力的抗肿瘤新药。 锤头状核酶切割hTR序列　　 核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能； Wan等，合成了一种甲基化修饰的锤头状核酶（2’-O-methyl-modified hammerhead ribozymes），具特异性切割hTR模板区序列的功能。 核酶：四膜虫 rRNA自我剪切 锤头状核酶切割hTR序列 将该酶与人神经胶质瘤U87-MG 细胞系的细胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明显抑制，这种抑制作用具有剂量依赖效应； Yokoyama等，设计了针对人端粒酶RNA模板区的锤头状核酶，能有效切割非细胞体系中的RNA底物，将其导入子宫内膜癌细胞后，可明显抑制端粒酶活性。 抑制端粒酶活性——抑制端粒酶催化蛋白亚单位 Horikawa等发现：将正常人3号染色体导入人肾癌细胞系RCC23，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的进行性缩短和细胞的老化，并且证实端粒酶活性的抑制是由于编码hTERT的基因的下调引起的，提示：3号染色体上存在直接或间接控制hTERT基因表达的基因； 最近大量研究表明：端粒酶三个主要组成成分中 hTERT与肿瘤的关系最密切，已成功将其克隆； hTERT有望成为肿瘤基因治疗的新的理想靶点。 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录　 端粒酶具有反转录酶活性，在催化合成端粒DNA的过程中，需要有4种 dNTP的参与； 利用核苷类似物?竞争性抑制反转录过程?抑制端粒酶活性?阻止端粒延长。 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录 Strahl等发现：双脱氧鸟嘌呤核苷（dideoxyguanosine，ddG）可使永生化的人淋巴细胞株 JY616 和 Jurkat E6-1的端粒发生进行性缩短和端粒酶活性的明显抑制，而且ddGTP也有类似的抑制作用。 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录 Melana等在培养基