第四章酶的分子修饰与模拟PPT.ppt

　酶 工 程Enzyme engineering;Chapter 4 Modification and simulation of Enzyme Molecule;酶分子改造的方向;生物酶工程;酶分子改造的方向;　1.　酶分子的化学修饰; 稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要 作用的最适条件不符 酶的主要动力学性质的不适应 临床应用的特殊要求;酶化学修饰的应用领域;研究活性中心的方法 （1）酶的专一性研究 （2）酶分子侧链基团的化学修饰法 （3）X射线晶体衍射法 （4）定点诱变法;一级结构测定步骤;多肽链的拆分 （二硫键的断裂） 方法一;多肽链的拆分（二硫键的断裂） 　方法二： 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下（解离多肽链之间的非共价力）；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。;+;S;+;在疾病治疗上 克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性 有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用 酶稳定性提高，使生产成本降低 反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。 ;2. 酶化学修饰的基本要求和条件;（1）了解被修饰酶的性质 酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。 酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。;2. 酶化学修饰的基本要求和条件;（2）选择修饰反应条件： 修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽 量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力回收要高。 ;（2）选择修饰反应条件;（1）酶的表面修饰 （2）酶分子的内部修饰 （3）与辅因子相关的修饰 （4）金属酶的金属取代 ;⑦反相胶团微囊化;（1）酶的表面修饰 ①化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。;②酶的小分子修饰作用：;酶的小分子修饰作用 对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺等。 氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲烊盐反应、甲醇-盐酸酯化反应等。 咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。 ; 吲哚基的化学修饰： 2-羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。 甲硫氨酸侧链基团的化学修饰： H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等 二硫键的化学修饰： 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。 酚基的化学修饰： N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、二异丙基氟磷酸。 胍基的化学修饰： 丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。;巯基的化学修饰 ;氨基的化学修饰 ;羧基的化学修饰 ;咪唑基的化学修饰 ;胍基的化学修饰 ;⑦反相胶团微囊化;糖类的修饰反应： 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是由? -葡萄糖通过? -1,6-糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要的修饰方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。 糖肽（ Glycopeptide)的修饰反应: 糖肽是由人纤维蛋白或? - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基反应。主要方法有：2,3- 异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。 聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。;;;;;合成大分子多聚物修饰酶 聚N - 乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP,经过开环水解,活化后,与酶结合。 聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。 聚丙烯醇(PAA):用分子量为250,000的PAA，经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。 聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。 聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。;天然大分子对酶的修饰反应 肝素：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20,000，是一种含硫酸酯的黏多糖；经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前