染料脱色劣势菌的特性及基因定位研究.pdf

l材料方法 1．1试剂与染料 酸性橙Ⅱ 天津染化二厂 活性艳兰KN．R浙江东港化工集团 溴氨酸浙江东港化工集团 纯化用胰蛋白胨：生化试剂 I『N口ATHLTD．ENGLAND UNIPATH 酵母粉：生化试剂 LTD．ENGLAND INC．USA 琼脂粉：ULTRA纯LIFETECHNOLOGES 三羟甲基氨基甲烷(Tris)：生化试剂华美生物公司Sigma进口分装 济南试剂总厂 乙二胺四乙酸二钠(EDTA．N幻)分析纯 TritonX一100：进口 异丙醇 溶菌酶 大肠杆菌(E，coliDH5，) 脱色优势菌NDlND2(由南开大学环境科学系筛选分离) 1．2培养基和琼脂糖凝胶电泳 菌株的培养均采用LB培养基。 琼脂糖凝胶电冰 O，001MEDTA 电泳缓冲液：1*TAE(Tri$～乙酸)：o．04MTri9一乙酸 40％(w／v)蔗糖水溶液 凝胶加样缓冲液：O．25％溴酚蓝o．25％二-苯青FF 凝胶中琼脂糖浓度为o．8％溴化己锭浓度为0．5克，毫升 1．3碳源利用试验 冲液洗涤数次，悬浮于相同的缓冲液中配成细胞悬液，吸取lml，加到不含任何碳源的无机 盐固体培养基中．制成平板，取浸有不同碳源物质的滤纸片，放于平板上，于37C培养， 观察纸片周围有无菌落生成。 1．4菌株好氧性试验 以穿刺法将菌株接种于固体培养基中，于37(2培养观察生长情况a 1．5温度和pit值对试验菌生长的影响p’ (1)菌株在相同温度(32C)不同pH值条件下的生长曲线测定 将基础培养基调pH值分别为pH6、pH7；pUS，然后接入菌株，于32℃摇床振荡培养· 在不同时间取下测其浊度。 (2)菌株在不同温度相同pH(pH；7)值条件下的生长曲线 将基础培养基均调为pH7，分别接入NDl、ND2菌株，接入方法同上，分剐于不同温度下 4C、37℃)，其它操作同前。 振荡培养(温度分别为24℃、28℃、32 1．6脱色能力的表征及脱色活力的测定 冲液洗涤数次，悬浮于相同的缓冲液中配成细胞悬液．反应体系中细胞浓度为40mg／ml(湿 重)，染料浓度100m虮，水浴放置，观察完全脱色时间，在染料的最大吸收峰处，测定反 应前后的吸光度，以百分数表示脱色率。 1．7质粒DNA的提取和检测州 利用煮沸法小量制各质粒DNA。具体方法：将振荡过夜培养的细菌，于8000×g离心 分钟，立即于10，000×g离心10分钟，然后用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入80ul 冰冻的异丙醇，充分混合，弃上清液，用70％E,酵洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸 上，使尽量干燥，再用20ulTE回溶沉淀，于．20。C冻存。 将已提取的质粒DNA(是否真正含有质粒尚未确定)，吸取20ul，加入4uL凝胶加样 缓冲液，充分混台后，从中吸取15ul，小心的加入点样槽中，之后再吸取4ulDNA标准参 照物，注入另一点样槽中，调节电压为5p_70mV电泳至第一条电泳带至攫个凝胶213处停 止．将胶小心取出，在紫外线照射下观察。 1．8质粒DNA的转化与转化子的获取挎1 将纯化后的质粒与一定体积的大肠杆菌感受态细胞混合，．20℃冷冻40分钟盾，在42 ℃热激1分钟，冰浴5分钟，将混台液加到含有LB培养液的瓶中，37℃高速振荡培养5 小时，之后将培养液(稀释到一定浓度)涂布在含有筛选压力的平板上，以检出转化子。 1．9转化子脱色能力表征 将转化子用牙签挑入LB液体培养基中培养过夜，取100mg／l酸性橙Ⅱ溶液4ml，加入 4ml转化子培养液，3TC培养、观察，并在其特征波长处测定吸光度值。 2结果与讨论 2．1碳源刹用情况 表1的结果表明：NDl可分别利用染料、蔗糖、葡萄塘、牛肉膏、及蛋自胨作为唯一 碳源；可分别利用染科+蔗糖、染料十葡萄糖、