黄崇庭-生化分析仪原理-比色法朗伯-比尔定律.ppt

(2)选择适当的吸光度范围: 对同1台仪器，△T为一定值。当吸光度读数落在0.2-0.65范围内，测定结果的相对误差较小。因此，需调节测定溶液的浓度，使其吸光度落在此范围内。 (3)选择适当的空白溶液: 测录吸光度时，通常利用空白溶液来调节仪器零点，这样可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。如果空白溶液选择不当，会使标准溶液不通过原点或不成直线。 ①溶剂空白: 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。? 操作方法：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 ②试剂空白 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。? 操作方法：用不加试样（用蒸馏水或其他纯溶剂代替试样），而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液 ③样品空白: 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。 操作方法：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 ④平行操作空白: 选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子，?操作方法：按试样组分完全相同的操作步骤，用不加被测试样组分的试样进行平行操作，以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。 ⑤不显色空白:在有的显色反应中，如改变试剂加入顺序或改变操作条件(如应加热改为不加热)，可使显色反应不发生，这样配制的空自溶液中有样品溶液或试剂的颜色，但待测组分未能显色(由于条件改变)即称为不显色空白。 6、郎伯比尔定律的定量分析方法 6.1 微量单组分测定 （1）标准曲线法:根据Lambent-Beer定律，在液层厚度、测定波长和其他测试条件保持不变时，则在一定浓度范围内，测得的吸光度与溶液中待测物质的浓度成正比。因此，可以用标准曲线法(称为校正曲线法或工作曲线法)进行定量。 标准曲线法是配制一系列不同浓度C的标准溶液，以不含被测组分的空自溶液为参比，在相同条件下测定标准溶液的吸光度A，绘制A-C曲线，这种曲线就是标准曲线。在相同条件下测定未知样品的吸光度，从标准曲线上就可找到与之对应的样品浓度。。 标准曲线法计算方式：因素法 A=KC，所以C=A/K，K是曲线的平均斜率；但是生化仪喜欢将K’=1/K,所以 C=K’ A,不同生化仪定标结果中的定标因子含义可能不同，后续。 标准曲线法计算方式：利用最小二乘法，线性回归计算 Y=aX+b R2 为相关系数，可以反映吸光度和浓度相关关系是否良好， Y为吸光度A，X为浓度，a为斜率，b为截距 所以 X=（Y-b)/a （2）标准对照法：标准曲线适用于一定截距不一定为0时，如果曲线过0点，可以直接采用 已知浓度Cs 和As,该法计算误差较大 (3)吸光系数法 A=εbc C=A/εb, 为吸光系数，b是溶液厚度 6.2、微量多组分测定 a、b不重叠直接测定 (1)联立方程法 (2)双波长测定法 双波长优点：可消除样品散射及其他物质的干扰、仪器杂散光以及光源的波动等的影响。 （1）等吸收波长法 （2）系数倍率法 7、朗伯比尔定律的扩展应用 朗伯比尔定律是研究吸光物质对光吸收的基本定律，那么对于光吸收不敏感的物质是否可以利用该定律进行测定？ 终点吸光光度法 动力学吸光光度法 谢谢 * * * 美康生物技术支持部 广西 黄崇庭 A=lg(I0/It)=εbc 1、前言 ALT AST TBIL DBIL TP ALB ALP GGT CR UA BUN………. TC TG HDL LDL……… CK CKMB HBDH LDH…….. ASO RF CRP CCP…….. 生化分析仪：一个可以靠??“灯泡”就能检测出人体血清、血浆中的各种成分的仪器？ Why? Why? Why? 2、光分析基础知识 2.1 光分析法的概念及分类 光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法； 相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等 根据是否有能级跃迁，可以分为 光分析法 光谱分析法：发射、吸收（原子吸收、分子吸收）、散射{拉曼光谱法） 非光谱吸收：反射、折射、干涉、衍射等 2.2 吸收光谱法 定义：各种物质由于其结构不同，对电磁波的吸收也不同，每种物质都有其特征性的吸收光谱，据此可对物质进行定量和定性分析的方法。 吸收光谱法 紫外可见光光度法： 紫外可见分光光度法是利用被测物质对紫外可见光