生物药物综合实验植物原生质体的制备.pptVIP

北京电子科技学院----生物系;实验 八;学习用酶溶解细胞壁的方法制备原生质体，为细胞生理研究提供必要基础。 掌握植物原生质体分离的基本原理及其操作过程 ; 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质，可通过混合酶液消化细胞壁而获得。原生质体经适宜的培养能合成新壁，并进行细胞分裂，经特殊诱导可生成完整植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 ; 材料：油菜或菠菜或烟草叶片 试剂： （1）酶混合液 1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇 0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.0 ? ;1.材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用 ;2. 酶解 将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液5ml到培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。黑暗下酶解1.5小时，中间轻晃几次。 ;3. 原生质体的收集与纯化 （1）将酶-原生质体混合液收集于10mL刻度离心管中，盖盖，600~800r/min离心7min，使原生质体沉降。 （2）去上清液，留沉淀即收集的原生质体。向离心管中缓缓加入0.16mol/L氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀，使沉淀悬浮。 ;（3）用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖液约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。 （4）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。 ;4、原生质体的观察 用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上，用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。 ;; 1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 ;1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 2、按镜下观察绘制原生质体。 ?