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中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 实验一 培养基的配置和灭菌 一、目的要求 1. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配置过程。 2. 了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 3. 熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。 二、实验材料 1. 药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4·7H2O、1N HCl、1N NaOH 2. 设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。 3. 材料：天平、药匙、电炉、pH试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签等。移液器（1mL 0.2mL）。 三、实验内容 （一）培养基的配制 1. 培养基的配制方法和步骤 1）称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。 2）溶化：在烧杯中加入所需水量，玻璃棒搅匀，加热溶解。 3）调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 4）加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。 5）分装：注意不要污染试管塞或纱布。 6）包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。 7）灭菌：在高压锅中，115℃高温灭菌30min。 2. 培养基的配制 A. 富集培养基（液体）： 海水2216E液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH8.0。取50m分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包一层牛皮纸，121℃高温灭菌20min。 B. 2216E斜面（固体）： 海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。 C. 无菌生理盐水和保种液： 生理盐水：NaCl 0.85% 蒸馏水配制。 每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121℃高温灭菌20min。 保种液：生理盐水，加25%甘油。 D. 碳源优化培养基： 以海水2216E液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。 （二）分离培养微生物常用器皿的准备 1）清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿等。 2）制作8层纱布，酒精棉。 3）Tip头（0.2,1mL，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）；保种管；药匙；长竹签。 4）卫生（308实验室超净台，实验台面） （三）培养基和玻璃器皿的灭菌方法 1. 加压蒸汽灭菌法。其步骤如下： 1）灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2）接通电源，进行加热。 3）排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力恢复到将近零时，再关闭排气阀。 4）当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌锅内的温度为121℃，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5）灭菌时间一到，切断电源。待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。 2. 紫外线灭菌 一般使用30W灯管，9m2空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此适用于空气表面杀菌。 3. 化学药剂消毒灭菌 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。 四、思考题 1. 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 答：（1）加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。（2）受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。（3）加热完毕后，要在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。 2. 培养基中加琼脂的作用是什么？ 答：培养基中加琼脂的作用是： 用作凝固剂。琼脂是多糖类物质，性质较稳定，一般稳定后不易分解，所以一般用作凝固剂而不引起化学成分的变化； 具有支持作用。琼脂冷却后是固体，可用于配置所需的固体培养基，作用类似于支架。 用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。 3. 如何检查培养基灭菌是否彻底？ 答：把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃