细胞工程_植物原生质体培养与体细胞杂交.ppt

1960年，英国植物生理学家Cocking首次获得烟草叶片原生质体，酶解细胞壁法。 1971年，Nagata 和 Takebe首次从烟草叶肉组织的原生质体中诱导出再生植株。 种间或属间甚至科间完成了原生质体融合，并再生为体细胞杂种（somatic hybrid）植株。 原生质体培养 Protoplast culture 主要目的：实现远缘物种的体细胞杂交。外源染色体、DNA或细胞器导入，创造远缘新种。 流程：原生质体分离 ? 原生质体培养 ? 体细胞杂交 ? 杂种细胞 ? 产生愈伤组织?再生植株。 原生质体：指植物细胞脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。 原生质体培养 ：指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。 原生质体培养的意义： 1．单细胞无性系的建立 2．遗传转化的良好受体。 3．多种基础研究的实验体系。 4．体细胞杂种的形成。 体细胞杂交的概念 又称原生质体融合（protoplast fusion） 指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 由融合细胞培养成的植株为体细胞杂种。 原生质体自发融合和诱发融合 当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质和细胞器通过膨大的胞间连丝融合形成同核体，实现原生质体的自发融合。仅限于同一物种内。 第二节 植物原生质体分离 细胞壁主要成分：纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。 原生质体分离方法： 机械分离法 酶解分离法 一、原生质体分离-机械分离法 方法：利器或机械磨损等，使细胞壁破损，促使原生质体释放。 将材料置于高渗糖溶液中预处理，使其发生质壁分离，然后用利刀切割或机械磨损组织，伤口处可以释放出完整的原生质体。 只能获得少量原生质体，完整的原生质体更少。 一、原生质体分离-酶解分离法 可获得大量原生质体。不必发生质壁分离，对活细胞的伤害较轻。 常用酶类： 纤维素酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶。 果胶酶类，包括果胶酶、离析酶。 蜗牛酶 胼胝质酶 二、原生质体的纯化 酶液处理后的混合液： 完整的未损伤原生质体 亚细胞碎屑（叶绿体和微管等） 未消化细胞 破碎或损伤原生质体等 清除这些杂质的过程为原生质体纯化。 纯化方法：沉降法 漂浮法 不连续梯度法 沉降法 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤，再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。 渗透压调节剂：甘露醇。 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径44~169μm，依原生质体大小来定。 离心：900~4500r/min。 漂浮法 方法：比重大的等渗溶液，使原生质体漂浮在液体表层。 渗透压调节剂：蔗糖。 优点：不易受损，成本低。 不足：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体不易漂浮。 不连续梯度法 采用两种比重不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。 三、原生质体活力测定 原生质体活力关系到细胞壁再生、细胞分裂和分化以及再生植株的形成，反映了原生质体分离和纯化技术的成败。 四、影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养成功的首要条件是获得大量、完整、有活力的原生质体。 影响因素主要有：供试材料、酶的种类和组合及酶解时间、渗透压稳定剂、质膜稳定剂、pH值、光照和温度等。 （一）供试材料 自然生长材料的幼嫩叶片。 无菌实生苗子叶和下胚轴。 外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物。 花粉细胞 （二）酶的种类、组合和酶解时间 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。 木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶，浓度为0.5%~2%。 (三) 渗透压稳定剂 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类等。 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定剂也不同。 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。 （四）质膜稳定剂 常用： 葡聚糖硫酸钾（0.2%~0.3%） MES[2-（N-吗啉）-乙烷磺酸] 氯化钙（0.1~1.0 M） 磷酸二氢钾等。 （五）pH值 酶的活性与pH值有关。 低pH值（4.5）：酶活力强，原生质体分离速度快，但原生质体活力差。 pH值偏高：酶活力差，原生质体分离速度慢，完整原生质体数目较多。 （六）光照和温度 酶的活力与温度也有关系。 酶