六、文库的构建(一).pptVIP

第六章 目的基因的制备 1、结构基因的组成 原核 真核 其它基因组 2、基因的排列 重叠基因 重复基因 加倍基因 基因重排 二、目的基因的制备 1、直接分离法 1）限制性内切酶酶切分离法 适于从简单基因组中分离目的基因 对已定序的DNA分子 对已定位的目的基因 对于含目的基因的DNA分子未定序或无定位 要求有简便的筛选方法： 利用特定基因缺陷型（如营养缺陷型等）的受体细胞，或特定的寡核苷酸DNA 片段探针以特定基因产物的抗体，可通过双表型的筛选或用分子杂交技术、免疫筛选技术检出目的基因。 示例：面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取 EcoRI 2）基因分离的物理化学法 基因工程初始阶段所用的方法，目前已不用。利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C、A T配对特性，分离目的基因。 密度梯度离心法 富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心可使不同DNA按密度大小分离非洲爪蟾rDNA、5SDNA和海胆组蛋白基因 单链酶解法 某基因片段中GC碱基含量高，可通过控制解链温度使富含A T区变性，富G C区维持双链，后用单链核酸酶S1酶切除单链部分 海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%（其稳定性高，溶解温度高），通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA，最后经氯化铯平衡梯度离心，得到相对分子量为1.9X107Dal的高纯rDNA。 分子杂交法 (hybridization) 单链DNA与其互补序列“配对成双”－－分子杂交 1969年美Beckwith成功分离了大肠杆菌乳糖操纵子的?－半乳糖苷酶基因 3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因 如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质，可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因。 基本原理： 核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体，而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸； 将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复合体； 当加入特定蛋白的抗体产生的第二抗体时，产生沉淀，就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖体从总多聚核糖体分离；再通过酚、氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱亲合层析，就可以得到为特定蛋白编码的mRNA，再通过反转录得到cDNA。 后来发现金黄色葡萄球菌的protein A可同IgG产生免疫反应而代替第二抗体，发展出protein A－Sepharose 4B作为亲和层析介质，分离特定的多聚核糖体。 2、构建基因组文库分离法 对于真核生物，基因组DNA十分庞大，基因可达数万个。 线虫，拟南芥，人类 单个基因在整个基因组中所占比例极小，无法进行特异性扩增，只能对所有的基因进行扩增 科学家完成精密版人类基因组图，遗传密码再被破译 国际人类基因组计划合作组织在2004年10月21日出版的英国《自然》杂志上宣布，一张精度大于99%、误差小于10万分之一的人类基因组完成图已成功绘就。经过多国科学家近3年的精心“修纂”，原本遗漏了15万个细节的“人类生命天书”几近完美（减少到现在的341个）。 ???? 透过这张完成图，科学家们发现了许多诱人的新秘密。尤为引人注目的是，完成图显示，庞大的人类基因组似乎只包含2万至2.5万个基因，大大少于此前估计。???? 国际人类基因组计划核心成员之一、美国冷泉港实验室教授林肯·斯坦在接受采访时指出：“在整个人类基因组测序工程中，研究者已经胜利攀登了一座高山，走过了一条漫长而艰险的道路。但这仅仅是‘开始的结束’ 。” ?国际人类基因组计划大事记????1990年10月国际人类基因组计划启动????1999年9月中国跻身人类基因组计划，承担1%测序任务????2000年4月人类基因组“中国卷”绘就????2001年2月人类基因组草图完成????2003年4月人类基因组精细图问世????2004年10月人类基因组完成图公布 国际人类基因组单体型图计划（HapMap） ??人类基因组拥有大约32亿对碱基。不同的人基因组中碱基对序列的99.9％都是一模一样的，只有不到千分之一左右的序列有所不同。这些差异的主要形态，是被称为“单核苷酸多态性”的DNA链上单一碱基对差异（SNP）。这不到千分之一的差异不仅决定了人们