小树骨髓细胞有丝分裂染色体制片.docVIP

小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体制片 姓名：路鹏 学号：0920212220 班级：生物技术0912 日期：2011年 12 月 14日 一、实验目的： 1、了解动物细胞染色体制片的原理； 2、学习骨髓细胞染色体的制片方法； 3、观察动物细胞染色体的数目和形态； 二、实验原理： 染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。 小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。 对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。 三、实验材料： 两个月龄的健康小鼠（2n=40） 四、实验仪器设备： 离心机、显微镜、剪刀、解剖刀、注射器及针头、刻度离心管、吸管、载玻片和盖玻片。 五、实验步骤： 1、前处理：取骨髓细胞前5－8小时向小鼠腹腔内注射秋水仙碱溶液。（每10克体重注入10-30μg秋水仙碱） 2、断颈椎法处死小鼠，剖出股骨，将股骨上的肌肉剔净用1％柠檬酸钠溶液洗净； 3、剪去股骨两端，用注射器吸取1％柠檬酸钠溶液2ml，将针头插入骨髓腔慢慢注射，将骨髓细胞冲入离心管中 (注意预温药液至37℃)，反复吹洗直至骨腔变白； 4、用吸管反复吹打骨髓细胞悬液几次，即得单细胞悬液； 5、细胞悬液1000rpm离心10分钟，吸去上清液，加0.075mol/L KCl 5～8ml，立即用吸管吹打均匀，室温下静置低渗20~25分钟。离心，去上清。 6、往低渗处理后的细胞悬液中加入5 ～ 8ml甲醇－冰醋酸 （3：1）固定液，吹打均匀进行预固定； 7、15min后对细胞悬液再次吹打，继续静置15min。 8、 离心10分钟，去上清，留约0.1 ～ 0.2ml的沉淀细胞和上清液，视细胞多少可再加甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液2 ～ 3滴，用吸管反复轻吸混匀，制成细胞悬液。 9、取冰箱中预冷的洁净载玻片(倾斜约30度)，用吸管吸取一滴细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀细胞，扩散平铺于玻片上，空气中自然干燥。 10、载玻片充分干燥后，用pH8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液+9份磷酸缓冲液混匀后扣染。材料面向下，用染液 浸润载玻片，染色15~30分钟，用流水洗去多余染液，再用吸水纸吸干多余水分，干燥后即可镜检。 六、注意事项 1、低渗与离心等步骤的操作要轻。 2、观察细胞的标准为：细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。染色体形态和分布良好。最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。 七、实验结果： 10倍镜 40倍镜 八、统计数据（根据我的制片中选取的六个视野） 制片编号 视野1 视野2 视野3 视野4 视野5 视野6 每100个细胞中细胞跌破数 5 11 16 18 8 13 综合六个视野平均跌破率为12% 九、实验心得： 这次的小鼠实验我们并不陌生，在实验老师一再强调要对这些动物感恩，而且操作时态度要认真。在操作时我们也尽快杀死小鼠，减少其挣扎的痛苦，而且操作时应该注意防止被小鼠咬伤。这次实验在操作上对我们来说是一种挑战，我们在取出小鼠大腿骨的时候，一定要带着盆腔剪下来，要注意保护关节，不要剪碎，剪开骨髓的时候，要注意好力道，防止剪坏了。还有就是我们又新接触了一个技术——空气干燥法。在滴片前，我们反复练习，最后我们组滴片还算比较成功，在滴片时候要多滴几滴，而且要保证一定的高度，我们实验图片中，很遗憾没能看到染色体，细胞跌破率较低，可能就是滴片时候高度不够的原因。这次实验最后能够成功真的很开心，也要感谢老师的指导。