蛋白质含量的测定(Folin—酚法).docVIP

实验报告 实验名称：蛋白质含量的测定（Folin-酚法） 实验日期： 班级： 学生姓名： 研究背景与目的：蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃，Folin-酚法是一种灵敏度极高，可快速测定蛋白质含量的方法，广泛地应用于蛋白质含量的测定。 本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法，同时熟练722分光光度计的使用和比色法。 实验原理：Folin-试剂是由两部分组成，甲试剂相当于双缩脲试剂，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液，在碱性条件下极不稳定，易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原，生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应。 根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下，兰色深度与蛋白的量成正比，可用比色法，使用分光光度计，通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定，再依据比例计算出蛋白质含量。 仪器与试剂：722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） 架盘天平 具塞刻度试管8支 15ml 移液器 100ul-1000ul和1ml-5ml 容量瓶 50ml*1 小烧杯 漏斗 研钵 Folin酚试剂：试剂甲 试剂乙 250ug/ml牛血清白蛋白标准原液 材料：绿豆芽下胚轴 实验步骤： 标准曲线的绘制 取6支15ml具塞刻度试管，编号。如下表所列加入相应试剂。 管号123456蛋白质含量（ug/ml）050100150200250加原液量（ml）00.20.40.60.81.0加dH2O量（ml）1.00.80.60.40.20步骤一各加入试剂甲5ml，混合后在室温下放置10分钟步骤二各加入试剂乙0.5ml立即混合均匀（速度要快），放置半小时步骤三以不含蛋白质的1号试管为对照，与其他5支试管内的溶液依次用722分光光度计于650nm波长下比色，记录各试管内溶液的消光值。以消光值为纵坐标，以牛血清白蛋白含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。 样品测定 称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中，匀浆。转入50ml容量瓶中，定容。然后过滤，滤液即为样品液。 取具塞刻度试管2支，编号8、9，分别加入滤液1ml，分别加入试剂甲5ml，混匀后放置10分钟，然后各加入试剂乙0.5ml，迅速混匀，室温下放置半小时，于650nm波长下比色，记录消光值，取其平均值完成计算。 数据整理与计算： 浓度（ug/ml）05010015020025071OD65000.1270.2570.3690.4700.5620.1740.1760.175表1 Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线 图1 从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X（ug/ml）=71ug/ml，然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量（%）=X(ug/ml)*样品总体积（ml）*100 样品重（g）*106 将数据X（ug/ml）=71ug/ml代入公式 样品中蛋白质含量（%）=71*50*100/(1*106)=0.355% 结果分析：经过本实验的数据计算，得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%，而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%，与实验测得相差一个数量级，但是与其他实验组的同学讨论得知，所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知，豆芽的品种不同，生长所需要的条件和时间也不尽相同，所以与网络查得的数据比较价值很小，而与其他组比较可知我组数据相对准确。 参考文献：/view/e4ec35360b4c2e3f572763f6.html 《蛋白质含量的测定》 /life/class/biochemistry/Experimentation/Ex08.doc 《Folin—酚法测定血清蛋白质含量》 /view/499547a6f524ccbff1218488.html《蛋白质含量测定——福林酚法》 /blog/static/2041113420100209343510/《Folin—酚试剂法（Lowry法）》 思考题： 为什么要求加入试剂乙后立即混匀？否则将会如何影响测定结果？ 已知试剂乙未磷钨酸和磷钼酸混合液，乙试剂在酸性条件下较稳定，在碱性条件下极不稳定。又知Fo