血浆载脂蛋白ApoAI的分离纯化.docVIP

血浆载脂蛋白A-I（ApoA-I）的分离纯化 [目的与要求] 掌握并提高生化实验基本原理及技术；了解生物大分子分离方案的设计及路径；培养生物化学领域的科研设计的能力。 [原理] 生物大分子主要是指蛋白质、酶、多糖和核酸。迄今已知的生物大分子的分离纯化方法很多，主要利用它们之间特异性的差异，如分子量大小、分子形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和对其它分子的亲和力等建立起来的。其主要原理基本可归纳为两个方面，一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两相或多相中，如盐析、盐溶、有机溶剂沉淀、共沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于单一的物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。目前纯化蛋白质的3种关键方法是电泳、超速离心和层析。由于生物大分子不能加热熔化、汽化，所能分配的物相只限于固相和液相、并在这两相之间交替进行分离纯化。因此，可将生物大分子制备方法按分子大小和形状、带电性质、溶解度、酸碱性、对其它分子的亲和力等主要因素分类（见下表）。 性质 具体方法 分子大小和形状 溶解度 电荷差异 生物功能专一性 差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等 电泳、等电聚焦、离子交换层析、吸附层析 亲和层析、疏水层析、共价层析 在实际工作中，往往综合使用上述几种方法才能制备出一种纯化的生物大分子。 分离纯化生物大分子总希望纯度好、产率高，但实际上，两者不能兼得。因此考虑分离纯化条件和方法时，不得不在两者间作适当的选择。一般，科研上更多考虑纯度，工业生产上更多选择产率。 在进行实践前，应进行充分的调查研究，查阅有关文献资料，对自己欲分离纯化的物质的物理、化学及生物学性质先有一定的了解，然后进行实验工作。对于一个未知的生物大分子试样进行创造性的分离纯化时，首先要确定研究的主要目的。如分离纯化肽类物质或酶类等，可参考已有的肽类或酶类物质分离纯化方法进行反复的摸索比较，找到一些工作规律，逐步达到预期的结果。在分离纯化工作中，另一重要工作是建立相应的分析鉴定方法及生物活性测定方法，即对目的活性物质跟踪分析，以便正确指导分离纯化工作一步步顺利深入进行，若要提纯一生物大分子达到一定纯度，一般要经过多种方法、步骤和不断变化操作条件才能达到目的，因此，整个实验过程中，各种方法的优劣，选择条件其效果的好坏，均需通过分析鉴定和生物活性测定来判断。 生物大分子一般需经过下列步骤（或其中几个步骤）才能分离纯化达到所需的要求。 一、前处理 包括生物材料的选择及处理、细胞破碎、细胞器分离及目的物提取。 选材主要根据实验目的而定，从工业生产角度选材，注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物材料原料。科研角度选材，则只需符合实验预定目标的要求即可。材料选定后，必须尽可能保持新鲜，尽快加工处理。如不立即进行实验或加工，则应冷冻保存。 若材料是提取液、体液（如血）、代谢排出液（如尿）、细胞外某些多肽激素、蛋白质、酶等则不需破碎细胞。若为细胞内生物活性物质则需细胞破碎，如科研上材料处理量少，则可用匀浆器或超声波处理法破碎；若处理材料量较大，则可用高速组织捣碎机。操作时，将调速器拨至所需速度档次，每次捣碎时间为5s，间歇30s，共捣碎5-6次。另外，破碎细菌细胞常用方法还有与石英砂研磨、高压挤压、交替冻融法或酶消化法等。 若目标物是分布在各种细胞器上的各类核酸或蛋白质，则尚需分离相应的细胞器。一般采用差速离心法。 经上述方法预处理的材料，需置于一定条件下和溶剂中，以提取目的生物大分子，使其以溶解状态充分的释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性。影响提取率的重要因素主要取决于提取物质在某一溶剂中的溶解度、由固相扩散到液相的难易、溶剂pH值及提取时间。一般的说，生物大分子提取时间愈长，溶解度愈大，则生物活性愈易丢失，同时杂质溶解度也增大，故提取的最佳条件的选择，必须综合分析各种影响因素，合理地搭配各种提取条件。 二、粗制分离 包括提取液浓缩和目的物的粗制 当生物大分子提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的目的物与其他大分子分离开来，一般，这一步如蛋白质和酶粗制时，主要用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。但分辨率低。 RNA和DNA的粗制用稀碱法、浓盐法、苯酚法等分级分离方法。 除此之外，有时粗制分离或精制分离前尚需用聚乙二醇吸收法、减压薄膜浓缩或超滤法等方法进行浓缩。