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原发性开角型青光眼MYOC基因C1009缺失突变致病机理的研究 谢小兵 湖南中医药大学第一附属医院 内容纲要 一、青光眼概述 二、原发性开角型青光眼突变 基因筛查 三、青光眼致病机理研究 --基因功能研究（细胞/动物水平） 一、青光眼概述 疾病基本特征：病理性高眼压、视神经萎缩、视盘凹陷扩大及进行性视野缺损（视力减退）。 病因：尚不清楚，一般认为是由多种因素引起。现认为主要是由遗传和环境因素相互作用所致。 前房形态 青光眼的遗传倾向：大量的家系调查发现，约13%～47%的开角型青光眼具有家族史，开角型青光眼发病率为2.8%～16.4%，远高于正常群体的发病率。 青光眼的相关致病基因：目前至少发现7条染色体与POAG相关。MYOC基因是最先确定的与POAG相关的致病基因。 已报道的与POAG有关的致病性MYOC基因突变 二、突变基因的筛查 研究发现在不同地区不同种族POAG的MYOC基因突变现象并不相同，MYOC 90%的基因突变位于第3个外显子。目前较肯定的与青光眼发病有关的突变有: Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse) 、 Pro370Leu、 Glu337Arg、Gly357Val等。 1. Transgenic Mice Expressing the Tyr437His Mutant of Human Myocilin Protein Develop Glaucoma Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 May ; 49(5): 1932–1939. 2. Expression of Mutated Mouse Myocilin Induces Open-Angle Glaucoma in Transgenic Mice The Journal of Neuroscience. November 15, 2006, 26(46):11903–11914 实验分组： 1. 青光眼家系组(56人） 2. 正常对照组（200例） 入选标准： 　 ⑴ 体检健康者；　 ⑵ 年龄20~60岁； ⑶ 无青光眼家族史； ⑷ 眼底及眼压检查正常者。 突变筛查： ④PCR产物酶切及突变分析： 2. MYOC 3片段全长189bp，未发生突变时有一个Alw261酶切位点，酶切后片段为93bp和96bp，若发生突变则酶切位点消失。经酶切，发现酶切后片段为93bp、96bp和189bp者3例，为杂合子，由于93bp和96bp两条片段只相差3bp，在8%的PAGE上分辨率比较低，只能观察到重叠影。证实发生了G227T突变。 3. MYOC 10片段全长190bp，未发生突变时有2个Bme1390Ⅰ酶切位点，酶切后片段为56bp、61bp和73bp，若发生1009位点突变，则酶切后片段为56bp和134bp。经酶切，发现酶切后片段为56bp和134bp者2例，片段为56bp、61bp、73bp和134bp者10例，存在1009位点C碱基缺失突变。 ⑤阳性PCR产物测序结果 将根据酶切筛选出的异常结果进行双向测序，测序表明在38位点C变为T，227位点G突变为A，在1009位点发生C碱基缺失。 ⑥统计学分析 在该56人的家系中， 227G→A、C1009del 和38C→T三种突变筛选情况如下表： 家系中三种突变的筛选情况 结论 1. 本研究在POAG家系中，共发现MYOC基因三个突变,分别是G227A、C1009del和C38T,其中后两个突变为首次发现。 2. G227A突变者3例，其中2例为已确诊的POAG病人,1例为家系中表型正常人，对照组中未发现 3. C1009del突变者12 例，其中11例已经确诊POAG,在1例4岁的子代亲属中也发现该突变。正常对照组中未发现 4. C38T突变存在于4例已确诊的POAG病人和1例可疑者中，正常对照组中未检出。这三个突变的发病率在家系组和正常对照有统计学意义。 （二）蛋白结构的生物信息学分析 进行蛋白质结构分析（蛋白质分析软件Antheprot4.3） 蛋白质一级结构分析 ： 1.第227位点的碱基改变G→A导致第76位氨基酸由精氨酸变为赖氨酸（Arg76Lys）。 2. 第1009位点的C碱基缺失(C1009del)导致终止密码子提前出现 3. 对38位C碱基突变为T碱基，导致第13位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。 3. C38T突变前后：