荧光分光光度法测定面粉中核黄素（VB2）7.ppt

荧光分光光度法测定面粉中核黄素（VB2） 一、实验目的 二、实验原理 三、FL-4500型气相色谱仪 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 一、实验目的 二、实验原理 强荧光物质 结构特点：?→?﹡ 、共轭 ? 体系、 刚性平面结构、 取代基 影响荧光发射溶液环境因素 p.362 ： （a）溶剂效应：取决于荧光体和溶剂的化学结构、极性、重原子效应 （b）温度：T ↑ φf↓ （c）pH 平衡解离关系 对?f.max、φf 均有影响 灵敏度高：测定下限在0.1~0.001 ?g/mL，比分光光度法高2~4个数量级。 光强I与I0的信号差别 ～ 荧光发射的光强 选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长 产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛，干扰物质较少 三、F-4500型荧光分光光度计 六、思考题 * 复旦化学系 教学实验中心 包慧敏 1、掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强度的影响。 2、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。 3、荧光分析法基本原理和学习测绘核黄素的激发光谱和荧光光谱，标准曲线法定量分析。 1、荧光、荧光分子/荧光物质 2、荧光分析法：特点 、定量方法 3、核黄素VB2：结构、性质、 面粉中提取方法 4、荧光分光光度计：结构、原理、操作 荧光产生的机制——去活化过程 问题1. 荧光、荧光分子 如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素在溶液中有很强的荧光，而酚酞没有。 如芴和联苯在相同的条件下，荧光量子产率约为1和0.18 溶液荧光的猝灭 p.364 荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭） 引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂。 问题2. 分子荧光分析法 1. 原子光谱与分子光谱 原子光谱：电子能级跃迁； 分子光谱：电子能级、振动能级、转动能级跃迁 2. 吸收光谱与发射光谱 吸收光谱：从低能级向高能级跃迁，使光的强度减弱； 发射光谱：从高能级跃迁回低能级，相应的能量以光的形式辐射出来 3. 关系 原子光谱：原子吸收光谱、原子发射光谱； 分子光谱：分子吸收光谱（可见、紫外、红外吸收光谱） 光谱名称的问题： 原子光谱 V.S. 分子光谱 原子光谱/线光谱： 电子跃迁能级 （单重态、三重态） 分子光谱/带光谱： 电子跃迁能级 分子振动能级 分子转动能级 激发光谱 荧光光谱 ?em.max处 IF～?ex 吸收光谱 V.S. 发射光谱 图15-3 三维荧光光谱的两种表示 （b）等高线光谱图 （a）等角三维投影图 分子荧光光度法的一些基本概念 激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途？ 荧光强度 IF 与荧光物质的溶液浓度 c 成线性关系 IF = 2.3?F I0? b c b — 试样的吸收光程 ? — 摩尔吸光系数 ?F —荧光发射的量子产率 IF — 荧光强度 当 I0 及 b 一定 稀溶液中 c — 试样浓度 IF = k c I0 — 入射光强度 荧光定量分析的基础 标准曲线法（工作曲线法） 1. 最大激发波长、最大吸收波长的选择； 2. 系列标准溶液绘制工作曲线； 3. 测定未知溶液，查得其浓度。 标准曲线法求解K ： （1）图解法 （2）解析法 分子荧光分光光度法 v.s. 紫外-可见分光光度法 比色皿： ？ 样品槽： F-4500型荧光分光光度计光路图 1、开机 Power-Xe lamp-Main 启动软件 FL Solutions Program F-4500型荧光分光光度计的使用 2、波长扫描 wavelength?? Scan Start — Method — Sample — Pre-scan — Measure —数据处理— Report Method: F-4500型荧光分光光度计的使用 1、试样溶液制备 2、实验条件的选择 3、标准曲线的绘制及样品的测定 四 、实 验 步 骤 关于核黄素VB2、面粉中提取方法 面粉主要成分 淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。《营养强化面粉国家标准》面粉中核黄素含量1×10-6～5×10-4g/L，回收率为98%～105%. 方法检出限4×10-8g/L 核黄素 又称维生素B2，维他命B2 Riboflavine C17H20O6N4 微溶于水；对空气、氧气稳定，对光敏感，在430~440nm蓝光照射下会在525