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转基因生物 植物转基因方法 调控元件：启动子、终止子、内含子、增强子等； 标记基因：hpt基因，NptII基因，GUS基因等； 目的基因：抗虫性状的cry系列基因、 抗除草剂性状的EPSPS基因、PAT基因、BAR基因等。 转基因作物现状 转基因检测方法分类 转基因检测方法分类 转基因成分PCR定性检测技术 转基因成分PCR定性检测技术 三种电泳检测的区别 转基因成分PCR定性检测技术 4、PCR反应程序 离心10 s后，将PCR管插入PCR仪中。 反应程序为：95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（94℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸30 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸7 min；4℃保存。（SPS、35S、NOS、Bt均使用相同的反应程序。） 反应结束后取出PCR反应管，加入约3μl的加样缓冲液，混匀备用。 转基因成分PCR定性检测技术 转基因成分PCR定性检测技术 电泳及分析 1、琼脂糖凝胶电泳 2、结果分析 3、异常情况分析 转基因成分PCR定性检测技术 1、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。 1）琼脂糖： 根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。 转基因成分PCR定性检测技术 2）凝胶浓度选择： 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 2.0 0.1～2 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 转基因成分PCR定性检测技术 3）电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解 转基因成分PCR定性检测技术 4）上样缓冲液（ Loading buffer ）： 一般由水、蔗糖和染料 (例如：二甲苯胺、溴酚蓝、溴甲酚绿等) 组成。 DNA 样品首先要与上样缓冲液混合，才能加入凝胶中电泳。 DNA 样品的最大上样量根据片段的数量而定。在0.5 cm 宽的条带中，能被凝胶成像仪检测到的溴化乙锭染色的DNA，最小量约为的2 ng。如果含有超过500 ng 的DNA，导致拖尾。 上样缓冲液有以下3 个作用： 增加样品的密度保证DNA 均匀加入到点样孔中； 使样品着色，以简化点样过程； 在样品中加入染料，能使其在电场中以可预见的速率移动。 转基因成分PCR定性检测技术 5）琼脂糖电泳的染色剂 最常用的染色剂： 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 极强的诱变剂/致癌物质，有慢性毒性。在操作时必须戴手套。 Gold View 一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。较为安全。 转基因成分PCR定性检测技术 6）DNA分子量标准： 为了判断DNA片段的大小，需要同时加入DNA分子量标准进行电泳。 DNA分子量标准应能覆盖所测DNA片段的预期大小。 转基因成分PCR定性检测技术 PCR产物电泳检测操作步骤： 1）制胶。将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2.0%（w/v）的琼脂糖溶液，然后按每100 ml琼脂糖溶液中加入5 μl EB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上（防漏胶），插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板（如样品孔内有气泡，应除去！）。 2）点样。吸取10 μl的PCR产物加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准；在点试样的同时，应同时点阴性对照、阳性对照和空白对照。 3）电泳。接通电源，在5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）条件下电泳30-40 min。切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）！ 基础电泳仪（100V左右） 高压电泳仪（2000V左右） 基础电泳仪（100V左右） 电泳仪 水平电泳槽