植物基因组DNA分离纯化及RAPD扩增.pptVIP

植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增 1、植物基因组DNA的分离纯化 一、实验原理 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA是双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器 DNA为双链环状分子，有些噬菌体DNA有时为单链环状分子。95%的真核生物DNA 主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。 从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核 糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和 细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶 于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞 液中分开。 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去， 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外， 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑 制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物 质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA 分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种 有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4- 10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂 类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体 的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1. 材料：水稻幼苗 2. 试剂： ① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巯 基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巯基乙醇， 加双蒸水(ddH2O)定容到100ml； ② 氯仿:异戊醇(24:1) ③ 洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g 乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④ 无水乙醇、70%乙醇； ⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 四、操作步骤 ① 取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管 中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20 ?l ?- 巯基乙醇，轻轻转动使之混匀； ②　样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒 混匀； ③　加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，室温下 放置5min，6000g离心10min。 ④　上层溶液转入另一个干净Eppendorf 管中，加入等体积 的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，６000g转离心5min； ⑤　重复步骤④ 2-3次，直至无白色界面物质 ； ⑥　将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的预 冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20℃下放置30min， 4℃、10000g转离心10min，弃上清液； ⑦　沉淀用加入1ml洗涤缓冲液，10000g离心1-2min； ⑧　沉淀用无水乙醇洗1次， 10000g离心1-2min； ⑨　沉淀置于空气中3-5min，晾干后加入15-20 ?l无菌水溶 解； DNA含量测定及电泳检测，琼脂糖浓度为