应用荧光光谱研究牛血清白蛋白和核黄素的相互作用.docVIP

应用荧光光谱研究牛血清白蛋白和核黄素的相互作用 　　采用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的光谱行为。结果发现，在温度为293K和310K时核黄素与BSA的结合常数(Kb)分别为4.879×105L?mol-1和1.880×105L?mol-1，结合热力学方程计算得到了对应温度下的热力学参数。结果表明核黄素对BSA有较强的荧光猝灭作用，其荧光猝灭过程属于动态猝灭机制，二者主要靠疏水作用力结合。采用同步荧光光谱探讨了核黄素对BSA构象的影响。通过对荧光光谱的研究，可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息，同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已有多篇文献采用荧光光谱法研究药物分子如槲皮素[3]、甲基硫菌灵[4]等与血清白蛋白的相互作用。 　　核黄素(Riboflavin，RI)又称维生素B2，是人体必需的13种维生素之一，具有促进发育和细胞的再生；促使皮肤、指甲、毛发的正常生长；消除口腔内、唇、舌的炎症；减轻眼睛的疲劳增进视力，协助代谢碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种功能。同时还具有利尿消肿，防治肿瘤，降低心脑血管病的发生等保健功效。 　　本文采用荧光光谱法研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA)间的相互作用，探讨了核黄素与BSA作用机制，计算得到荧光猝灭常数，以及与BSA作用的结合常数和结合位点数等信息。 　　1　实验部分 　　1.1　试剂与仪器 　　RF25301型荧光分光光度计(日本，岛津公司)；UV28453型紫外分光光度计(日本，日立公司)；TB285型恒温水浴(日本，岛津公司)；pHSJ24ApH计(上海雷磁仪器厂)。 　　牛血清白蛋白(Amresco.0930，分子量:65000)；核黄素(中国药品生物制品检定所)；pH=7.40的Tris2HCl缓冲溶液；以Tris2HCl缓冲溶液为溶剂配制1.0×10-3mol?L-1的BSA标准溶液，1.0×10-3mol?L-1核黄素标准溶液，两种标准溶液均在0～4冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris，HCl，NaCl均为分析纯；水为双重蒸馏水_。 　　1.2　实验方法 　　在10mL比色管中依次加入pH=7.40的Tris2HCl缓冲溶液2mL，1.0×10-3mol/LBSA溶液0.5mL以及一定量核黄素溶液，用0.1mol/LNaCl水溶液稀释至刻线后混匀，在实验温度下恒温1h，采用1cm石英池，激发波长为285nm，绘制300～450nm的荧光光谱，并分别以△λ=60nm和△λ=15nm扫描其同步荧光光谱，测定时入射狭缝均为10nm，出射狭缝均为5nm。 　　2　结果与讨论 　　2.1　荧光猝灭光谱 　　按照实验方法测定不同温度条件下BSA溶液中加入不同量核黄素的荧光光谱(图1)。 　　由于蛋白质中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有内源荧光，由图1可知:当固定BSA的量，随着核黄素浓度的增加，BSA的荧光强度不断降低，荧光峰逐渐蓝移，说明核黄素与BSA发生了相互作用，这种作用可能引起BSA中荧光发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化[5]。进一步研究发现在293K和310K条件下加入核黄素的浓度与BSA荧光猝灭值△F(△F=F0-F，F、F0分别指有无RI时的荧光强度)分别在0～0.6×10-5mol/L、0～0.4×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，回归系数R分别为0.9982、0.9938，该法可用于核黄素浓度的测定。 　　2.2　荧光猝灭机理及结合常数的基本确定 　　引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循Stern2Volmer方程[6]。 　　F0/F=1KSV[Q]=1Kqτ0[Q](1) 　　式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂物质的荧光强度；[Q]为猝灭剂的浓度，KSV为动态猝灭常数，Kq是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数[7]。τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10-8s[8]。而静态猝灭过程遵循下式: 　　F0/F=1KS[Q](2) 　　式中，KS是静态猝灭常数。随温度的升高动态猝灭常数会增大，而静态猝灭常数随之减小，可由此判断荧光猝灭类型。 　　根据Stern2Volmer方程绘制不同温度下的(F0/F-1)～[Q]曲线，结果显示，随温度升高曲线斜率增大，表明猝灭机理为动态猝灭。表1为不同温度核黄素对BSA荧光猝灭的Stern2Volmer方程及猝灭常数。各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数约为2×1010L?mol-1?s-1，而从表1结果来看，Kq数量级在1013(Kq=KSV/τ0)，由此可知，猝灭机理似乎应为静态猝灭，但考虑到离子强度是影响猝灭系数的重要因素，