俞萍闫小毅肌营养不良症DMD基因检测课件_1.ppt

实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。 Genetics of DMD OMIM# 310200 occurring in about 1 in 3500 males, X-linked recessive, lethal in males, 1/3 of patients are new mutants; 2/3 have carrier mothers, Gene location Xp21, large gene (more than 2000 kb), 79 exons. High mutation rate, 60% to 65% of the mutations are deletions, and about 6% are duplications , Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.  * * Duchenne Muscular Dystrophy, DMD DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。 DMD基因4个外显子的引物顺序见表： 外显子 PCR产物大小 引物F 引物R 8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag 19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc 45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。 * *