第十章外源基因表达和基因工程药物.ppt

第十章外源基因表达与基因工程药物 第一节 概 述 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。 一、基因表达基本原理 基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。 蛋白质合成的特点 二、基因表达基本类型 第二节外源基因表达基本过程 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达 【四个要素】 工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞 一、目的基因的获得 外源基因表达的第一步是获得目的基因 获得目的基因的主要方法包括： ①化学合成 ②RT-PCR从含有目的基因的总RNA或mRNA中扩增 ③从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增 ④通过杂交技术筛选 ⑤利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选 PCR反应五要素 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR反应的特异性决定因素： 引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性 二、目的基因与表达载体的重组 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体。 （一）载体 对于外源基因的表达，第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。 表达载体主要包括：质粒载体、噬菌体或病毒载体。 表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。 pBR322质粒 分子量较小。 两种抗菌素抗性基因 较高的拷贝数，且经氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝 对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点 pUC质粒 多克隆位点； 松弛复制； 氨苄青酶素抗性； 可通过化学显色筛选 M13噬菌体载体 优点： 既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。 缺点：插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。 穿梭载体(shuttle vector) 真核细胞载体 哺乳动物细胞的病毒载体 含有原核基因序列即：复制子和抗性基因 含有哺乳动物细胞启动子和增强元件使外源基因有效转录 转录终止信号和poly(A)信号 含有可选择的剪切信号 含有一个以上的限制性酶切位点 真核细胞载体 酵母载体 组成—遗传标记；调控序列（ARS、环状质粒DNA、启动子）；由质粒DNA与酵母DNA重组的穿梭质粒 杆状病毒载体—昆虫细胞多角病毒载体 具有蛋白修饰、加工和转运体系 产物可溶性表达 适于克隆大片外源DNA 不侵染脊椎动物 （二）重组 体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于：选择合适的重组位点、剪切位点；以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。 对于表达用宿主细胞还应该有： ①有较好的翻译后加工机制 ②蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低，以减少外源蛋白的降解实现高效表达 第二部分 重组基因工程药物 一、重组人胰岛素及其突变体 1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市 胰岛素种类 （一）按来源不同分类 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、生物合成人胰岛素：利用生物工程技